Современные методы идентификации "черной" икры

Первые сведения о производстве икры в Астраханской области относятся к XVIII веку, другие источники свидетельствуют о поставке икры к царскому столу еще в XVI веке. Расцвет производства черной икры пришелся на XIX-й и XX-й века, когда мировым центром вылова и обработки осетровых видов рыб стала Астраханская губерния (Астраханская область). Это определялось биологическим разнообразием осетровых рыб Волжско-Каспийского бассейна, спецификой промысла и технологией производства икры. Рыбу вылавливали во время нерестового хода в реки, икру получали исключительно от живой рыбы.

Влияние комплекса природных (сейсмические явления, водность, колебания солености и уровня воды, изменения кормовой базы) и антропогенных (активное освоение запасов осетровых, ННН-промысел, развитие хозяйственной деятельности) факторов привели к катастрофическому состоянию популяции осетровых и полному запрету их промысла. Из 27 видов рыб отряда осетрообразных, 85% находятся на грани исчезновения [1, 2].

Запрет на коммерческий вылов (добычу) осетровых рыб из естественных водоемов привел к активному развитию аквакультуры и получению новых пород гибридов. В связи с успехами в области товарного осетроводства и его перспективного икорно-товарного направления, появились возможности использования различных видов сырья для изготовления икорной продукции. Согласно данным Росстата объем продукции икорно-товарного осетроводства в 2018 г. составил 44 тонны [3]. На прилавки торговых организаций вернулась икорная рыбная продукция, полученная от рыб осетровых видов и пород, выращенных в искусственных условиях.

На сегодняшний день российскими хозяйствами-лидерами икорно-товарного осетроводства являются ООО «Рыбоводно-воспроизводственный комплекс «Раскат» (г. Астрахань), ООО «Астраханская Рыбоводная Компания «Белуга», РТФ «Диана» (Волгоградская область), ООО «Кармановский рыбхоз» (Республика Башкортостан, г. Уфа), ГК «Русский икорный дом» (Вологодская обл.), ГК «Горкунов» (Московская область), ООО "РК "Акватрейд" (г. Астрахань), ООО «Кубанский завод осетровых» (Краснодарский край), Ржевский рыбоводный комплекс (бренд «Золото Каспия», Тверская область), Волгореченское рыбное хозяйство (Костромская область, г. Волгореченск) [4]. Обеспечение должного качества и безопасности, выпускаемых предприятиями post@vestnik-vsuet. ru икорных рыбных изделий возможно посредством соблюдения действующих межгосударственных и национальных стандартов, нормативных документов.

Отличаясь высокой стоимостью и уникальной пищевой ценностью, черная икра имеет устойчивый спрос у потребителей, как в пределах страны, так и за рубежом, что сформировало проблему ее частой фальсификации – информационной, ассортиментной, квалиметрической, количественной. Согласно данным СИТЕС, в 2018 году на долю икры, полученной из аквакультуры, приходилось 95% общего мирового импорта по весу. Это означает, что икра, полученная от диких осетровых, все еще реализуется [5].

Под видом черной икры рыб семейства осетровые и веслоносые реализуется крашеная икра частиковых видов рыб, недорогая имитированная или аналоговая продукция, натуральная икра с добавлением 15–20% искусственной. Так, по данным лаборатории молекулярной генетики ФГБНУ «ВНИРО» в 2018 г. зафиксировано 1075 случаев нарушений при реализации продукции из осетровых видов рыб:

• •    12 банок икры, маркированной как продукция аквакультуры РФ различных хозяйств, при проверке оказалась икрой, произведенной в аквакультуре республики Китай;

• •    1 банка икры с аквакультурной продукцией РФ не соответствовала видовому составу, указанному на банке;

• •    806 банок – браконьерская продукция Дальневосточного происхождения;

• •    58 банок – браконьерская продукция Каспийского происхождения;

• •    191 банка – нелегальная продукция аквакультуры из Китая;

• •    7 банок – имитация икры, искусственный продукт.

Кроме этого, на рынке встречается продукция, изготовленная с несоблюдением технологии производства, режимов хранения, допустимых норм закладки консервантов, с внесением пищевых добавок, не включенных в нормативную или техническую документацию (загустители, красители, стабилизаторы цвета) или полученная нелегальным способом. Таким образом, для фальсификации икорной продукции складывается благоприятная ситуация в связи с отсутствием законодательно закрепленных документов, обязывающих проводить молекулярно-генетический анализ.

В Российской Федерации одним из приоритетных направлений развития рыбохозяйственного комплекса является обеспечение населения пищевой рыбной продукцией,

Харченко Н.Н. и др.

соответствующей требованиям Технических регламентов Евразийского экономического союза. Пищевая рыбная продукция должна обладать совокупностью характеристик, включающих безопасность, потребительские свойства, энергетическую и пищевую ценность, аутентичность. Для обеспечения населения безопасной и качественной пищевой рыбной продукцией должны соблюдаться требования технических регламентов [6], Федерального закона Российской Федерации № 184-ФЗ «О техническом регулировании» [7], Федерального закона Российской Федерации № 162-ФЗ «О стандартизации в Российской Федерации» [8], стратегии повышения качества пищевой продукции в Российской Федерации до 2030 г. [9].

Материалы и методы

Пробы икры рыб веслоносых и осетровых, (русского и сибирского осетра, шипа, белуги, стерляди, бестера), массой по 50 грамм отбирали в пластиковые банки с закручивающимися крышками на НЭКА БИОС ВКФ «ФГБНУ» («КаспНИРХ») в весенний и осенний периоды 2019 г. Образцы щучьей, лососевой, имитированной осетровой и окрашенной щучьей икры были приобретены в розничных магазинах г. Астрахань.

Отличительные характеристики различных видов рыб устанавливали в соответствии с ГОСТ 30812–2002. При проведении идентификации 15–20 штук интактных икринок исследуемых видов помещали в стакан с кипящей водой на 5 минут. Объемное соотношение пробы и воды 1:40. В результате кипячения содержимое икринок коагулировало, после чего они легко разрезались.

Другую часть икры в количестве 15–20 штук фиксировали в 4% растворе формалина или растворе Буэна кипячение не проводили. Далее раствор формалина из банки с пробой сливали, пробы промывали большим количеством дистиллированной воды. После фиксации икринки разрезали скальпелем на две половины. Пробы паюсной, икры рассекали так, чтобы получить тонкий срез-пластинку. Пробы просматривались под микроскопом при увеличении от 40 ^х до 60 ^х .

Для определения микропилярных каналов (микропиле) у икринки находили анимальный полюс, разрезали. В срезанную часть икринки между оболочкой и цитоплазмой вводили препаровальную иглу, отделяя цитоплазму от оболочки.

Исследование химического состава образцов икры проводили по ГОСТ 7636–85.

Результаты и обсуждение

В соответствии с действующими документами идентификацию икры рыб семейства осетровые проводят по ГОСТ 30812–2002 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации икры рыб семейства осетровых». [10] Действующий стандарт был разработан на основе методики «Сырье и продукты пищевые. Методика идентификации икры рыб семейства осетровые в сырье, полуфабрикатах, икорных продуктах». Положения, приведенные в ней, предусматривали способы идентификации икры-сырца от осетровых рыб естественных популяций («диких») стандартной стадии зрелости или икорной продукции путем определения морфологических признаков. Однако результаты такой оценки не дают полного представления о виде рыбы, от которого получена икра и ее происхождении.

Согласно требованиям технического регламента ЕАЭС 040/2016 «О безопасности рыбы и рыбной продукции» (далее ТР ЕАЭС 040/2016) [6], продукция из икры рыб (икра – зерно, зернистая, ястычная, паюсная, пастеризованная и икорные рыбные изделия), является объектом технического регулирования.

Процедуру идентификации пищевой рыбной продукции осуществляют одним или несколькими методами: по наименованию, визуально, органолептически, аналитически.

Для такого уникального сырья, как черная икра данные методы идентификации относительны и большей частью субъективны. При этом органолептический метод применяется если невозможно идентифицировать продукцию по наименованию и визуально. Аналитический метод используется в случае невозможности идентификации продукции одним из перечисленных методов и осуществляется установлением тождественности показателей продукции (морфологических, физических, химических, биохимических и микробиологических) аутентичным природным образцам. Определить происхождение производителя икры (дикого, выловленного из природных водоемов; аква-культурного, выращенного в полувольных условиях или искусственно созданной среде обитания) органолептически, визуально или по наименованию невозможно.

Аналитический метод идентификации, основанный на анализе химического состава икры-сырца осетровых видов рыб, веслоноса и щуки (наиболее часто окрашиваемую и имитируемую под черную икру осетровых рыб) также показывает сопоставимые значения. Например, содержание белка в икре находится в близких интервалах (для белуги и осетра от 23,0 до 27,5%, севрюги и щуки – от 26,4 до 30,0%). Данные о размере икринок рыб, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что наиболее крупными являются икринки белуги (до 5,0 мм), мелкими – веслоноса (до 1,2 мм), размер икринок остальных рыб в среднем составляет 3,0 мм.

Таблица 1.

Химический состав и размер икринок некоторых видов рыб

Table 1.

Chemical composition and size of the eggs of some fish species

Виды рыб Fish species	Среда обитания Habitat	Содержание, % | Content, %				Размер икринок, мм Size of eggs, mm
		Белок Protein	Жир Lipid	Вода Moisture	Мин. вещества Ash
Белуга (Huso huso)	естественная wild	23,5–27,5	14,5–17,5	51,0–58,0	1,2–1,5	3,0–5,0
	аквакультура aquaculture	25,0–26,5	12–14,0	58,0–60,0	1,0–1,5	3,0–4,5
Стерлядь | (Acipenser ruthenus)		16,5–17,5	16,0–17,5	56,0–58,0	1,0–1,2	1,9–2,5
Севрюга | (Acipenser stellatus)	естественная wild	26,5–30,0	12,5–18,0	47,5–55,0	1,2–1,5	2,0–3,0
Осетр | (Acipenser gueldenstaedtii)		23,0–27,0	11,0–17,0	51,5–58,5	1,2–1,5	3,0–4,0
	аквакультура aquaculture	26,0–28,0	14,0–15,5	55,0–57,0	1,4 – 1,5	3,0 – 3,5
Веслонос | (Polyodon spathula)		25–27,5	14,5–16,0	55,0–57,0	1,5–1,8	1,0–1,2
Шип | (Acipenser nudiventris)		24–26	15–16	59–62	1,4–2,0	2,5–3,4
Щука (Esox lucius)	естественная wild	26,4–29,8	1,5–2,5	64,6–68,3	1,9–2,0	2,5–2,6

Примечание: Химический состав рыб естественной среды обитания – литературные данные [11] Note: Chemical composition of fish of natural habitat – literary data [11]

Очевидно, что достоверно идентифицировать принадлежность икры к семейству осетровые или веслоносые по химическому составу невозможно, так же как и выявить факты фальсификации или легальности происхождения [12].

В ходе разработки стандарта были исследованы и уточнены морфологические характеристики ооцитов рыб семейств осетровые и веслоносые, выращенных в условиях аквакультуры. Отмечен комплекс выбранных идентификационных признаков, который соответствует строению и свойствам исключительно ооцитов рыб отряда осетрообразные: внешний вид икринок, состояние цитоплазмы и оболочки после фиксации, структурированность оболочки, наличие структурных признаков для пигментированной и непигментированной икры. Установлено, что в спорных случаях, следует проводить дополнительный анализ по определению наличия микропиле (особенно важный признак идентификации икры рыб семейств осетровые и веслоносые, подделать который практически невозможно). Расположение микропилярных каналов в ооцитах рыб семейства веслоносые аналогично осетровым: они пронизывают оболочки яйца на небольшом участке анимального полюса.

Кроме того, проведённые опыты показали, что икринки аналоговой икорной продукции при кипячении разрушаются, желточная масса не коагулирует. У некоторых образцов аналогов икры, оболочка при кипячении не разрушается, сохраняет форму, но при этом значительно светлеет, бульон приобретает характерную окраску (становится розовым, мутным или темно-серым, с ярко выраженным рыбным запахом, на поверхности появляются капельки жира). В имитированной икре локализация пигментов всегда разная: встречаются образцы с однородным окрашиванием всего объёма интактной икринки, беспорядочное вкрапление цветных частиц или наблюдается окрашивание верхней оболочки.

Таким образом, при осуществлении актуализации положений разрабатываемого проекта ГОСТ и лабораторных исследованиях идентификации проб икры была подтверждена работоспособность методики. Однако, разрешающая способность предложенного варианта идентификации ограничивается способностью отличать икру осетровых (без идентификации до вида) от икры других видов рыб (лососевых, щуки,), а также от полностью искусственных подделок.

Для борьбы с фальсификацией требуется надежная система прослеживаемости по всей цепочке производства икорной продукции (от места получения икры до прилавка), в основе которой должно быть применение современных методов объективного анализа [13]. Опытным путем установлено, что метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием ДНК оптимален для определения видовой принадлежности черной икры и установления наличия примесей икры других видов рыб, в том числе подвергавшейся термической обработке.

Учитывая приведенные факторы, при пересмотре стандарта ГОСТ 30812 – 2002 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации икры рыб семейства осетровых» [10] было принято решение о расширении области его применения дополнительным объектом стандартизации (веслонос) и молекулярно-генетическим методом анализа.

Такой подход обусловлен включением рыб семейства веслоносые в Перечень видов животных и растений, подпадающих под действие конвенции о международной торговле видами дикой фауны и флоры, находящимися

ХарченкоН.Н. и Др. ВестникВГУИТ, 2020, Т. 82, №. 3, С. под угрозой исчезновения (СИТЕС) [1], а также утверждением Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019–2027 годы, применяемых в животноводстве и аквакультуре [14].

Молекулярно-генетический метод анализа устанавливает способ секвенирования ДНК по Сенгеру с использованием флуоресцентно-меченных терминаторов реакции и капиллярного электрофореза [15]. Распространяется на секвенирование участков ДНК разного происхождения с подобранными условиями амплификации при условии получения специфического ампликона без дополнительных полос и допускает изменение качественного состава праймеров для амплификации ДНК. Представленный в проекте стандарта молекулярно-генетический метод анализа может применяться для идентификации икры-сырца и продукции из нее таких видов рыб семейства осетровые как русский осетр «GUE» ( Acipenser gueldenstaedtii ), русский осетр «BL» (гаплотип baerii-like ) ( Acipenser gueldenstaedtii ), сибирский осетр ( Acipenser baerii ), белуга ( Huso huso ), калуга ( Huso dauricus ), шип ( Acipenser nudiventris ), стерлядь ( Acipenser ruthenus ), севрюга ( Acipenser stellatus ), амурский осетр ( Acipenser schrenckii ), китайский осетр ( Acipenser sinensis ) и семейства веслоносые ( Polyodon spathula ).

Выявление и фиксация видовых, расовых и экологических различий таксономических единиц тестируемой икры позволит определять принадлежность производителей к определенным осетровым рыбоводным заводам РФ и осуществлять контроль за деятельностью браконьеров, что обеспечит выпуск качественной и безопасной икорной продукции.

В актуализированном проекте стандарта дополнительно разработана форма заключения идентификации икры рыб молекулярно-генетическим методом.

Работы по актуализации положений стандарта были проведены подкомитетом по стандартизации, функционирующем в Волжско-Каспийском филиале ФГБНУ «ВНИРО» («КаспНИРХ») № 7 «Волжско-Каспийский рыбохозяйственный бассейн» технического комитета по стандартизации МТК/ТК300 «Рыбные продукты пищевые, кормовые, технические и упаковка». Исследования по выявлению особенностей макро- и микроскопической структур икринок осетровых видов рыб были проведены сотрудниками «Каспрыбтехцентр». Особенности внешнего и внутреннего строения гибридов ооцитов осетровых и веслоносых рыб установлены сотрудниками группы стандартизации и нормирования Волжско-Каспийского филиала ФГБНУ «ВНИРО» («КаспНИРХ»). Молекулярногенетический метод разработан в лаборатории молекулярной генетики ФГБНУ «ВНИРО».

Актуализированный ГОСТ будет востребован исследовательскими лабораториями, экспертами рыбоохраны, надзорными организациями, осуществляющими учет и контроль производства и обращения продукции из осетровых видов рыб.

Заключение

Актуализированный стандарт ГОСТ 30812 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации икры рыб семейства осетровых», устанавливающий современные аналитические методы идентификации икры осетровых рыб и веслоносых, обеспечит нормативно-техническую базу функционирования системы прослеживаемости от места получения икры-сырца до мест сбыта, что позволит значительно снизить долю нелегальной, контрафактной и фальсифицированной икорной продукции.