Современные подходы и методология экологического мониторинга в условиях водоема и в аквакультуре

Промышленное освоение, связанное с разведкой и последующей разработкой месторождений полезных ископаемых, а также развивающиеся технологии воспроизводства рыб в аквакультуре в значительной

степени влияют на водные растения, животных и среду их обитания. В результате хозяйственной деятельности человека происходит угнетение отдельных видов в водных биоценозах вследствие деградации их местообитания, что в ряде случаев приводит к необратимым последствиям. Отрицательные последствия нерационального проведения рыбоводных мероприятий проявляются в виде изменений в генетическом составе природного пула генов, которые можно обнаружить только в процессе генетического мониторинга (анализа состояния популяционных генофондов, их динамики во времени и пространстве). Контроль состояния экосистемы включает нормирование значимых для живых организмов факторов среды и дифференциацию их по степени опасности с последующим мониторингом; выбор биоиндикаторов и определение экологического состояния системы с их помощью. Биоиндикация – это обнаружение и определение экологически значимых природных и антропогенных нагрузок на основе реакций на них живых организмов непосредственно в среде их обитания [5]. Основной задачей при этом является разработка методов комплексного мониторинга состояния ключевых биоиндикационных групп организмов в соответствии с предполагаемым воздействием на водоем [4]. Существует несколько классификаций биоиндикаторов: например, они подразделяются на экосистемные и факторные индикаторы здоровья (с соответствующими подразделениями), на экологические, оценочные, индикаторы исполнения и т.п. [13]. Однако во всех целевых классификациях присутствуют те или иные меры биологического разнообразия, поскольку его нарушение является одним из наиболее важных последствий антропогенного пресса, в результате чего снижается устойчивость водных экосистем и их способность к самоочищению. Биоиндикаторы – организмы, наличие, количество или особенности развития которых служат показателями естественных процессов, условий или антропогенных изменений среды обитания [5].

Для оценки возможного социального ущерба от изменения экологического состояния водоемов мы предлагаем мониторинг сообществ микроорганизмов и рыбного населения как ключевых индикаторных групп с использованием современных молекулярно-генетических методов.

Микроорганизмы (одноклеточные про- и эукариоты, вирусы) - наиболее распространенные обитатели пресноводных водоемов. Развитие свободно живущих микроорганизмов и их активность находятся в прямой связи с составом органических и неорганических веществ в водной среде, т.к. они способны разрушать соединения естественного и антропогенного происхождения. С другой стороны, микроорганизмы, ассоциированные с высшими эукариотами, оказывают существенное влияние на динамику численности и структуру популяции своих хозяев, прямо или косвенно регулируя их численность. Поскольку водные микробные сообщества, также как и симбиотические ассоциации микроорганизмов с водной растительностью и с промысловыми водными объектами – рыбами наиболее быстро реагируют на изменение окружающей среды, они являются самыми чувствительными биоиндикаторами, и их мониторинг будет способствовать эффективному учету возрастающей антропогенной нагрузки.

Пригодность рыб как биоиндикаторов определяется рядом критериев: при-надлеж-ностью к разным звеньям трофической цепи, отсутствием дальних миграций (наличием местных популяций), широким ареалом распространения, принадлежностью к естественным сообществам (несинантропные виды), численностью вида обеспечивающей достаточный материал для анализа и доступными простыми методами сбора материала. Байкальские сиговые рыбы (сем. Coregonidae) – сложный комплекс близкородственных видов и популяций, современное генетическое разнообразие которых формировалось непосредственно в озере на протяжении не менее миллиона лет. Как объект интенсивной хозяйственной деятельности человека они особенно нуждаются в генетическом мониторинге. В то же время, будучи хорошо изученными морфо-экологическими методами, эти виды рыб могут быть использованы для апробирования самих методов мониторинга.

Методы и технические средства проведения мониторинга (биоиндикации) растений, животных и микроорганизмов приведены в сводках и специализированных обзорах и сборниках [1, 2, 4-6, 12, 14, 17]. Молекулярно-биологический подход в настоящее время широко используется не только для изучения генетического разнообразия природных микробных сообществ, диагностики бактериальных инфекций объектов мари- и аквакультуры, но и является единственно возможным методом, позволяющим осуществлять эффективный контроль состояния генофонда рыб в условиях активного рыборазведения и промысла [18, 19]. Преимущество подхода для мониторинга микробных сообществ заключается в возможности: 1) фиксации биологического материала в полевых условиях; 2) анализа всего разнообразия микроорганизмов, включая виды, культивирование или длительная транспортировка которых по тем или иным причинам затруднительна.

Апробацию методов мониторинга проводили на водотоках Иркутской области, принадлежащих к бассейнам крупных сибирских рек – Ангара, Лена и Енисей. Объектами для работы послужили пробы воды, ила, макрофитов и лососевидные рыбы (Salmonoidei). Для разработки диагностического подхода бактериальных инфекций в аквакультуре использовали лососевидных рыб из карантинного и экспозиционного аквариумов Байкальского музея ИНЦ СО РАН.

Пробы речной воды для проведения микробиолого-вирусологического мониторинга фильтровали через бактериальные фильтры и проводили молекулярногенетический анализ микробного разнообразия из ДНК, выделенной с фильтров, а наличие вирусных частиц определяли в фильтрате. Проведенная нами серия экспериментов показала, что после оптимизации количественного отбора водных проб из рек возможен анализ разнообразия водных микроорганизмов на консервативных и групп-специфичных бактериальных праймерах. Микроорганизмы, ассоциированные с кожными покровами рыб, имеют такой же состав таксономических групп, как и в водных пробах олиготрофных водных экосистем (отмечены представители альфа- и бета-подгрупп протеобактерий) [10]. Среди представителей этих таксономических групп, известны широко распространенные в водной среде бактерии, которые могут быть использованы в качестве индикаторных при мониторинге симбиотических ассоциаций. Отработаны методы микробиологической оценки состояния водной растительности. Для анализа использовали препараты ДНК, выделенные разными методами, проведены и адаптированы условия ПЦР как с универсальными, так и групп-специфичными праймерами.

Для изучения сообществ микроорганизмов ценных промысловых видов лососевидных рыб, являющихся перспективными объектами искусственного воспроизводства методы молекулярно-генетического анализа нами адаптированы ранее [3, 9, 15]. Получены первые результаты по генетическому разнообразию кишечной микрофлоры. В целом следует отметить невысокую гомологию полученных последовательностей с известными культивируемыми штаммами, невысокое разнообразие и преимущественное доминирование двух генотипов некультивируемых спирохет и Mycoplasma sp. В качестве сопутствующих получены генотипы представителей рода Pseudomonas, некультивируемых грамположительных бактерий семейства Enterobacteriaceae и эукариотического микроорганизма Spironucleus barkhanus.

Диагностика бактериальных инфекции на основе видо-специфичной амплификации проведена для бактерий Aeromo-nas hydrophila и Pseudomonas anguillisep-tica в условиях аквариумной экспозиции. Эти микроорганизмы широко распространенны в воде естественных водоемов. В нормальных условиях водные организмы обладают устойчивостью и вырабатывают вещества, предупреждающие развитие инфекций. Для апробации метода проводили анализ соскобов с кожных покровов рыб с явными признаками заболеваний, внешне здоровых рыб и проб воды из аквариумов. Условия видо-специфичной амплификации подобраны для анализа соскобов с кожных покровов рыб. Произведен подбор условий детекции ДНК A. hydrophila и P. anguil-liseptica в воде, учитывая необходимость в наиболее простом и не травматичном для рыб отборе проб для регулярного мониторинга их численности. Регулярные обработки дезинфицирующими средствами, по-видимому, приводят к стерилизации воды в аквариуме, таким образом, более информативной становится ранняя диагностика бактериальных инфекций непосредственно с кожных покровов рыб, а также анализ осадка (фекалии рыб, остатки кормов) на дне аквариума.

В связи с тем, что активное развитие грибковых инфекций рыб является одним из признаков экологического неблагополучия, существует необходимость выявления инфекционных агентов, вызывающих эти заболевания. Этиологическими агентами микозов рыб являются виды, принадлежащие родам Achlya, Dictyuchus и Saprolegnia. Это условно-патогенные организмы, которые вызывают заболевание «сапролегниоз» у всех искусственно вос- производимых видов рыб. Сапролегниозом обычно поражается травмированная или ослабленная рыба и икра во время ее инкубации. Заболевание широко распространено в рыбоводных хозяйствах разного профиля, когда плотность рыбного населения слишком высока или когда диета рыб недостаточно сбалансирована. Нам удалось отработать методику детекции эукариотических микроорганизмов, принадлежащих к сем. Saprolegniaceae, являющихся возбудителями микозов рыб. При анализе банка данных последовательностей генов рибосомной РНК были подобраны и проверены наиболее перспективные для диагностики праймеры на ген 18S рРНК и на второй внутренний транскрибируемый район. Эта система позволяет получить специфический фрагмент гена рибосомной РНК в один этап. В спорных случаях для подтверждения положительного результата необходимо дополнительно проводить второй раунд ПЦР с полученного ампликона на внутренних праймерах [8].

В геноме байкальского омуля ( Core-gonus migratorius ) осуществлен поиск мик-росателлитных локусов, пригодных для анализа популяционной структуры сиговых рыб. Проведен дизайн праймеров для их амплификации и тестирование на популяциях байкальских сиговых. Полностью охарактеризованы на больших популяционных выборках локусы (Bom22b, Cam1, Cam5) [7]. В дополнение к найденным, протестированы и отобраны для дальнейшей работы локусы (Bwf1, Bwf2, Cocl23), известные ранее для близких видов рыб. По двум локусам (Bom22b и Bwf1) проведен анализ полиморфизма байкальских омуля, озерного ( Coregonus baicalensis ) и озерно-речного ( C. pidschian ) сигов, на естественных и используемых человеком (промысел, искусственное воспроизводство, браконьерский лов) популяциях рыб [16]. Определены популяционногенетические параметры популяций, позволяющие косвенно судить о тенденциях изменения генетического разнообразия. Полученные результаты согласуются с особенностями исследуемых популяций и интерпретируемы в контексте влияния на них хозяйственной деятельности человека.

Использование ранней и эффективной диагностики бактериальных, протозойных и вирусных инфекций необходимо не только на разных технологических этапах в современной аквакультуре, но и при оценке негативных последствий для биоты водоема с целью сохранения флоры и фауны как хозяйственных объектов и как носителей генетической информации. Методика сравнительного анализа генетического поли-морфизма позволит контролировать состояние промыслового стада и своевременно корректировать планы рыбоводных мероприятий с целью минимизации отрицательных последствий для естественных популяций рыб и экосистемы в целом.

Внедрение разработанных методов должно быть предусмотрено при реконструкции и модернизации рыбоводных заводов как один из обязательных этапов технологического процесса (контроль состояния производителей, икры, личинок, молоди, кормов, среды обитания и нагульного стада). Это значительно сократит риск возникновения эпизоотий в аквакультуре и в условиях водоема и, следовательно, повысит эффективность рыбоводных мероприятий. Разработка вышеуказанных методов в комплексе с дистанционным учетом акустико-траловым методом [11] обеспечит точную информацию о текущем состоянии популяций рыб в водоеме, необходимую для экологического мониторинга и разработки правильной стратегии (структуры) промысла. Кроме того, предложенная методология может стать основой для создания технологии повышения эффективности и контроля результативности рыбоводных мероприятий в аквакультуре и в условиях водоема.

Работа поддержана инновационным проектом «Тест-системы для диагностики бактериальных инфекций рыб» 2008 г. ИНЦ СО РАН и грантами РФФИ № 01-04-97202-р2001байкал, 03-04-48856-а, 07-04-00883-а, выполнена в рамках программы РАН №23, подпрограммы 1, проект 23.13 (20092010 гг.) и интеграционного проекта СО РАН № 6 (рук. Н.Г. Мельник).