Современные подходы к оценке и классификации опасности веществ, обладающих мутагенным действием

Хамидулина Халидя Хизбулаевна – доктор медицинских наук, директор; профессор, заведующий кафедрой гигиены (e-mail: ; тел.: 8 (499) 145-60-23; ORCID: .

Рабикова Динара Нуруллаевна – врач по общей гигиене; ассистент кафедры гигиены (e-mail: ; тел.: 8 (499) 145-60-23; ORCID: .

Тарасова Елена Владимировна – кандидат химических наук, заместитель директора (e-mail: ; тел.: 8 (499) 145-60-23; ORCID: .

Синицкая Татьяна Алексеевна – член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, руководитель Центра по гигиеническому нормированию химических веществ в воздушной среде и почве (e-mail: ; тел.: 8 (495) 586-11-44; ORCID: .

Замкова Ирина Валентиновна – врач по санитарно-гигиеническим лабораторным исследованиям (e-mail: ; тел.: 8 (499) 145-60-23; ORCID: .

Назаренко Андрей Константинович – химик-эксперт; аспирант (e-mail: ; тел.: 8 (499) 145-60-23; ORCID: .

Технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности химической продукции» (ТР ЕАЭС 041/2017), а также проекта национального Технического регламента «О безопасности химической продукции». Официальный статус перечня мутагенов будет способствовать не только принятию релевантных управленческих решений, но и разрешению споров, возникающих между бизнес-сообществом и контрольно-надзорными органами вследствие различий в интерпретации результатов исследований.

Эффективным инструментом в области химической безопасности является создание национальных перечней супертоксикантов: канцерогенов, мутагенов, репродуктивных токсикантов и эндокринных разрушителей, которые широко используются в международном законодательстве для принятия адекватных управленческих решений по минимизации риска воздействия химических веществ на всех стадиях их жизненного цикла [1–5].

Филиалом РПОХБВ ФБУН ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрис-мана Роспотребнадзора разработаны перечни репродуктивных токсикантов и эндокринных разрушителей, которые легли в основу методических рекомендаций, утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека1, а также технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности химической продукции» (ТР ЕАЭС 041/2017) и национального регламента РФ «О безопасности химической продукции»2. Что касается канцерогенов, то перечень веществ, отнесенных Международным агентством по изучению рака (МАИР)

к канцерогенам, включен в СП 2.2.3670-20 «Санитар-но-эпидемиологиические требования к условиям тру-да»3. Между тем в настоящее время в Российской Федерации и в других государствах Евразийского экономического союза отсутствует перечень химических веществ, обладающих мутагенным действием.

В связи с этим цель исследования – отбор веществ, обладающих мутагенным действием, и научное обоснование подходов к оценке и классификации их опасности для создания национального перечня.

Материалы и методы. С целью выявления веществ-кандидатов, обладающих генотоксическим / мутагенным действием, и формирования их токсикологического профиля для оценки степени опасности проведен анализ международного законодатель-ства⁴, документов структур Организации Объединенных Наций, научных статей, монографий, сведений Федерального регистра потенциально опасных химических и биологических веществ⁵ и других официальных национальных и зарубежных баз данных. Классификации потенциальных мутагенов основывались на принципах СГС⁶ [6–10].

Результаты и их обсуждение. Для оценки генотоксичности мировым сообществом разработано и валидировано более 20 тестов, позволяющих выявлять способность химических факторов повреждать генетический материал в клетках, вызывая определенные типы мутаций. Универсального теста, позволяющего оценить способность химического соединения к индукции разных типов мутаций в зародышевых и соматических клетках, не существует, поэтому используется комплекс методов, выполняемых на разных тест-объектах в условиях in vitro и in vivo [11–13]. Анализ токсикологических профилей веществ-кандидатов для включения в национальный перечень позволил по информативности, репрезентативности и воспроизводимости результа- тов выделить приоритетные для изучения мутагенности методы, представленные в табл. 1.

Как показала практика, на репрезентативность оценки потенциальной генотоксичности влияет выбор методов исследования. При этом необходимо принимать во внимание неопределенности, возникающие при экстраполяции на организм человека результатов исследования, полученных на животных, а в случае противоречивых данных следует искать подтверждение достижения химическим веществом органа-мишени (наличие токсического проявления, в том числе канцерогенности) [13, 16–17].

При оценке мутагенов применяется рекомендованный международными организациями принцип этапности исследований.

Таблица 1

Приоритетные методы изучения мутагенности

№ теста ОЭСР7	Наименование	Тип метода	Тестовый организм (вид)	Метаболическая активация	Принцип исследования
471	Метод оценки обратных мутаций на бактериях – тест Эймса	In vitro	1)    Salmonella typhimurium 2)    E. сoli	+S9/ –S9	Определение обратных мутаций у исследуемых штаммов, позволяющих микроорганизмам синтезировать определенную аминокислоту [14]
476	Методы оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro с использованием генов Hprt and xprt genes	In vitro	Культуры клеток млекопитающих и человека (мышиная лимфома L5178Y, клеточные линии CHO, AS52, V79 китайского хомячка; лимфобластные клетки человека TK6 и другие)	+S9/ –S9	Обнаружение генных мутаций, индуцируемых химическими соединениями
490	Методы оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro с использованием гена тимидинкиназы	In vitro	Культуры клеток млекопитающих и человека (мышиная лимфома L5178Y, лимфобластные клетки человека TK6)	+S9/ –S9	Обнаружение мутаций генов, вызванных химическими веществами
473	Метод оценки хромосомных аберраций у млекопитающих in vitro	In vitro	Клеточные линии или первичные клеточные культуры клеток млекопитающих и человека (фибробласты китайского хомячка, лимфоциты периферической крови человека и млекопитающих и другие)	+S9/ –S9	Выявление факторов, которые индуцируют структурные аберрации хромосом (хроматидные и хромосомные) в культивируемых клетках млекопитающих
474	Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих	In vivo	Млекопитающие, преимущественно мыши, крысы (эритроциты)	Нет	Идентифицировать вещества, вызывающие цитогенетические нарушения, приводящие к формированию микроядер, содержащих отставшие при делении фрагменты хромосом или целые хромосомы
478	Генетическая токсико логия: метод доминантных леталей на грызунах	In vivo	Грызуны (мыши, крысы) (половые клетки)	Нет	Оценка постимплантационной гибели
489	Анализ ДНК-комет в клетках млекопитающих in vivo	In vivo	Млекопитающие, преимущественно мыши, крысы (cоматические клетки)	Нет	Используется для выявления и оценки уровня повреждений (разрывов) нити ДНК в эукариотических клетках [15]

На первом этапе до решения вопроса о целесообразности проведения исследований осуществляется оценка всех имеющихся в наличии данных о воздействии химического вещества на человека и животных с использованием официальных источников информации, наиболее приоритетные представлены в табл. 2.

На втором этапе проводится оценка данных, полученных на основе моделирования с использованием количественного и качественного соотношения «структура – свойство», включающего анализ близких по структуре и биологическому действию веществ. Одним из перспективных методов прогнозирования мутагенного действия является система «QSAR Toolbox», разработанная ОЭСР [18–20]. С целью активного внедрения прогностических систем в практику отечественной профилактической токсикологии Филиалом подготовле-

ны пособия «Общее пособие по прогнозированию токсических свойств химических веществ»8 и «Прогнозирование мутагенного действия химических веществ»9.

Первый и второй этапы предоставляют исследователю возможность официально применять наработанные международным научным сообществом данные по опасности и оценке риска вещества. Аналоговый подход, успешно использовавшийся в советские годы в целях гигиенического нормирования, в настоящее время широко применяется для прогнозирования опасности.

На третьем этапе проводятся исследования (испытания) in vitro на различных тест-объектах, в том числе бактериях, зародышевых и / или соматических клетках млекопитающих.

На четвертом этапе в случае необходимости проводятся исследования (испытания) in vivo .

Таблица 2

Перечень рекомендуемых официальных информационных источников, используемых для сбора данных о воздействии химических веществ

№ п/п Наименование Источник (ссылка) 1 База данных Федерального Регистра потенциально опасных химических и биологических веществ 2 АРИПС «Опасные вещества» 3 База данных Европейского химического агентства (англ. European Chemicals Agency’s (ECHA) Dissemination portal with information on chemical substances registered under REACH) 4 Глобальный портал информации о свойствах химических веществ (англ. еChemportal) 5 База данных по прогнозированию токсичности (англ. ToxCast – Toxicity Forecasting) 6 Р 2.1.10.3968-23. Руководство по оценке риска здоровью населения при воздействии химических веществ, загрязняющих среду обитания / утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 06 сентября 2023 г. 7 База данных ОЭСР QSAR Toolbox 8 Комплексная информационная система по вопросам риска Агентства по охране окружающей среды США (англ. Integrated Risk Information System (IRIS) US EPA) 9 Монографии Международного агентства по изучению рака (МАИР) по оценке канцерогенного риска для человека 10 База данных свойств химических веществ GESTIS 11 Справочная база данных по токсичности (англ. ToxRefDB – Toxicity Reference Database) 12 Регистр токсических эффектов химических веществ (англ. CCOHS RTECS – Canadian Centre Occupational Health and Safety, Registry of Toxic Effects of Chemical Substances) 13 База данных об опасных свойствах химических веществ Национальной медицинской библиотеки США (англ. Hazardous Substances Data Bank (HSDB))

Таблица 3

4,4'-Оксидианилин (СAS 101-80-4)
Параметры острой токсичности	Тип метода	Результаты тестирования
DL50 570 – 725 мг/кг, в/ж, крысы DL50 685 мг/кг, в/ж, мыши DL50 700 мг/кг, в/ж, кролики DL50 650 мг/кг, в/ж, морские свинки DL50 > 2500 мг/кг, н/к, кролики DL50 365 мг/кг, в/б, крысы DL50 300 мг/кг, в/б, мыши DL50 650 мг/кг, в/б, кролики	In vitro	Опыт 1: 250, 500, 1000, 2500, 5000 мкг/чашка и опыт 2: 10, 25, 50, 100, 250 мкг/чашка, S. typhimurium TA 1535, TA 1537, TA 98 и TA 100, в присутствии системы метаболической активации – значительное увеличение частоты мутаций у штаммов TA 1535, TA 98 и TA 100 (метод ОЭСР № 471 – положительный)
		50, 100, 160, 500, 1000, 1600, 2000, 3000 мкг/мл в отсутствии системы метаболической активации и 160, 500, 1000, 1600, 2000, 3000, 4000, 5000 мкг/мл в присутствии системы метаболической активации, клетки яичника китайского хомячка (CHO) – значительное увеличение частоты хромосомных аберраций в клетках CHO) (метод ОЭСР № 473 – положительный)
		5; 16; 50 мкг/мл в отсутствии системы метаболической активации и 160, 500, 1600, 2000, 3000, 4000, 5000 мкг/мл в присутствии системы метаболической активации, клетки яичника китайского хомячка (CHO) – значительное увеличение частоты обмена сестринскими хроматидами в клетках CHO (метод ОЭСР № 479 – положительный)
	In vivo	37,5; 75; 150 мг/кг, в/б, 3 дня, мыши – статистически значимое увеличение частот микроядерных полихромных эритроцитов (метод № 474 – положительный)
		40; 180; 725 мг/кг, в/ж, однократно, крысы – не вызывал незапланированного синтеза ДНК в гепатоцитах крыс (метод № 486 – отрицательный)
Наличие данных о канцерогенном действии	По материалам МАИР данные о канцерогенном действии для животных достаточные – группа 2B. При длительном в/ж введении вещества крысам и мышам обнаружены доброкачественные и злокачественные гепатоцеллюлярные опухоли, а также доброкачественные и злокачественные фолликулярные опухоли щитовидной железы; при нанесении на кожу возникало большое количество злокачественных опухолей печени (гепатоцеллюлярные, холангиомы)
Класс опасности 1В
Обоснование отнесения к классу опасности: отнесение к классу 1В основано на результатах трех положительных тестов in vitro на бактериях и соматических клетках в присутствии и отсутствии системы метаболической активации и одном положительном тесте in vivo , а также материалах МАИР о подтвержденном канцерогенном действии на животных

Примечание: в/ж – внутрижелудочно, в/б – внутрибрюшинно.

Таблица 4

Гидрохинон (CAS 123-31-9)

Параметры острой токсичности	Тип метода	Результаты тестирования
DL 50 320–1050 мг/кг, в/ж, крысы DL50 350 мг/кг, в/ж, мыши DL50 > 2000 мг/кг, н/к, кролики	In vitro	10; 33; 100; 333; 666 мкг/пластина, S. typhimurium ТА 1535, ТА1537, TA98, TA100, в присутствии и отсутствии системы метаболической активации – отсутствие мутагенной активности (метод ОЭСР № 471 – отрицательный)
		От 2 до 100 мкг/мл для 3-часовой обработки, от 5 до 15 мкг/мл для 24-часовой обработки и 10 мкг/мл для 48-часовой обработки, лимфоциты человека, в присутствии и отсутствии системы метаболической активации – отсутствие биологически значимого или статистически значимого увеличения числа клеток со структурными аберрациями (метод ОЭСР № 473 – отрицательный)
		Тестовые концентрации, связанные с умеренными или значительными цитотоксическими эффектами, культуры клеток млекопитающих, лимфоциты человека – хромосомные аберрации, микроядра и обмен сестринскими хроматидами (метод ОЭСР № 473, метод ОЭСР № 479 – положительные)
		1,56; 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50 мкг/мл в отсутствии системы метаболической активации и 0,652; 1,25; 2,5; 5; 10 мкг/мл в присутствии системы метаболической активации, клетки лимфомы мыши L5178Y (метод ОЭСР № 476 – положительный)
	In vivo	25; 50; 75 мг/кг, в/б, однократно, мыши – увеличена частота микроядерных полихромных эритроцитов (метод ОЭСР № 474 – положительный)
		80 мг/кг, в/ж, однократно, мыши – слабое увеличение микроядер (метод ОЭСР № 474 – положительный)
		30; 100; 300 мг/кг, в/ж, 10 недель, крысы – не вызывал доминирующей летальности (метод ОЭСР № 478 – отрицательный)
		40; 80; 120 мг/кг, в/б, однократно, мыши – статистически значимо возросли частоты аберрантных клеток (хроматидные аберрации, исключая пробелы) в сперматоцитах мышей (метод ОЭСР № 483 – положительный)
		25; 50; 100; 200 мг/кг, в/ж, 4 недели, мыши-самцы – отсутствие значительного увеличения частоты мутаций (метод ОЭСР № 488 – отрицательный)

Классификация опасности гидрохинона по мутагенному действию

МАИР отнес к группе 3 (невозможно классифицировать как канцерогенные для человека). Данные Наличие данных о кан- еогенном ействии по канцерогенности для животных признаны ограниченными (в исследованиях на мышах и крысах церое о де с       при пероральном введении наблюдалось увеличение множественности опухолей пищевода и почек)

Класс опасности 2

Обоснование отнесения к классу опасности: отнесение к классу 2 основано на разнонаправленных результатах тестов in vitro и in vivo , а также на материалах МАИР об ограниченном подтвержденном канцерогенном действии для животных

Примечание: в/ж – внутрижелудочно, н/к – накожно.

однако в исследованиях in vivo отмечалось разнонаправленное действие: наблюдалось статистически значимое увеличение частоты микроядерных полихромных эритроцитов в методе ОЭСР 474 и отсутствие незапланированного синтеза ДНК в гепатоцитах крыс в методе ОЭСР 486. В то же время вещество отнесено МАИР в группу 2B на основании развития злокачественных опухолей печени при различных путях поступления у крыс и мышей, что позволило классифицировать его как мутаген класса опасности 1В.

К классу опасности 2 отнесено 226 веществ. К классу опасности 2 следует относить химические вещества с доказанной мутагенностью в исследованиях in vivo на соматических клетках млекопитающих и (или) испытаний генотоксичности in vivo на соматических клетках, подтвержденных положительными результатами испытаний мутагенности in vitro. Кроме того, химическое вещество или смесь может классифицироваться как мутаген класса опасности 2 при наличии положительных результатов, полученных в тестах in vitro на клетках млеко-

питающих и тестах in silico с использованием моделей «структура – активность» QSAR.

Класс опасности 2 также присваивается в случае разнонаправленных результатов тестов in vitro и in vivo при наличии в материалах МАИР данных о канцерогенности (табл. 4). Несмотря на разнонаправленные данные in vitro и in vivo , гидрохинон отнесен к классу опасности 2 на основании положительных результатов в исследованиях in vivo на половых клетках, а также сведений о канцерогенности при пероральном введении мышам и крысам (опухоли пищевода и почек).

Если вещество классифицировано по СГС как канцероген класса опасности 1, но отсутствуют экспериментальные данные по изучению мутагенного действия, то его рекомендуется классифицировать как мутаген класса опасности 2 [6, 7, 16].

Класс опасности химического вещества может быть пересмотрен при получении новых экспериментальных данных по мутагенности и (или) канцерогенности.

Ограничения исследования. Классификация не распространяется на препаративные формы и действующие вещества пестицидов и агрохимикатов.

Выводы. Комплексный подход к выбору, оценке и классификации опасности химических веществ, обладающих мутагенным действием, позволил научно обосновать и сформировать национальный перечень мутагенов, который вошел в проект методических рекомендаций «Оценка и классификация опасности мутагенов». Внедрение перечня в методическую и нормативно-правовую базы Российской Федерации и Евразийского экономического союза позволит минимизировать риск воздействия химических веществ на здоровье человека и окру-

жающую среду, обеспечить прозрачность управленческих решений и широкое информирование населения.

Финансирование. Исследование выполнено в рамках реализации научно-исследовательской работы «Разработка комплексных подходов к тестированию, оценке опасности и риска воздействия химических веществ на здоровье человека и совершенствование доказательной базы результатов токсикологических исследований» по отраслевой программе Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.