Создание ассоциаций пробиотиков для пищевых продуктов и кормов

Создание новых пищевых продуктов и кормов с пробиотическими свойствами требует современного научного подхода к выбору микроорганизмов и их ассоциаций с учетом показателей симбиотической сочетаемости и отсутствия антагонизма. За последние годы проведен целый ряд исследований по изучению механизма межштаммовых взаимодействий пробиотических бактерий [1–3]. Разработаны принципы эффективности пробиотических штаммов в части выживаемости в условиях желудочно-кишечного тракта и достижения антагонистической активности [4–6], расширяется применение методов молекулярно-генетической идентификации штаммов для обеспечения показателей безопасности пищевой и кормовой продукции [7–8]. Имеются результаты исследований по изучению новых вариантов бактериальных ассоциаций на основе использования их технологически ценных свойств [9–10].

Несмотря на все увеличивающийся массив научных публикаций, остается актуальной получение современной информации о вновь селекционированных пробиотических штаммах и сконструированных на их основе ассоциациях, использующихся в качестве пробиотиков. Требуют научного и экспериментального обоснования вопросы повышения биосинтеза биологически активных веществ.

Цель работы – конструирование ассоциаций пробиотических бактерий с использованием комплекса современных методов микробиологических исследований для использования в функциональных пищевых продуктах и кормовых добавках. Задачи исследования – подобрать симбиотические сочетания штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий с высоким уровнем накопления биомассы.

Материалы и методы

Объектами исследования являлись культуры бактерий из коллекции ВНИИПБТ, полученные методом многоступенчатой селекции: Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48, Lactobacillus plantarum 314/7, L. рlantarum 578/25, L. acidophilus 1660/15, L. helveticus 842 (D) – 2, L. casei subsp. rhamnosus М 536/12, Propionibacterium. freuden-reichii subsp. shermanii Ас-103/12, Pr. shermanii К-16 . Культивирование и количественный учет микроорганизмов проводили на среде MRS, в анаэробных условиях при 37 °C после внесения 10% посевной культуры от объема питательной среды. Исследование биологической совместимости молочнокислых бактерий проводили по капельной методике [11]. Количество биомассы определяли методом взвешивания, количество живых микроорганизмов – путем высева на плотные питательные среды после приготовления разведений.

Результаты

Выбранные штаммы молочнокислых бактерий имеют определенную схожесть физиологобиохимических свойств и являются активными продуцентами молочной кислоты Проведены исследования штаммов на биологическую совместимость, результаты представлены на рисунке 1.

На фотографии видны четкие границы между каплями культуральной жидкости штаммов под номерами 1, 3 и 5, что свидетельствует об отсутствии биосовместимости пар штаммов-продуцентов. У пар штаммов под номерами 2 и 4 выраженная граница роста практически отсутствует, что свидетельствует о симбиотических взаимодействиях культуры Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48 с культурами L. рlantarum 578/25 и L. helveticus 842 (D) – 2. Проведена серия ферментаций на среде MRS, что позволило подтвердить парную совместимость штаммов: Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48 с Lactobacillus. рlantarum 578/25 и Lactobacillus helveticus 842 (D) – 2.

Рисунок 1. Проверка биосовместимости штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48 : 1 – Lactobacillus plantarum 314/7 , 2 – L. рlantarum 578/25 , 3 – L. acidophilus 1660/15 , 4 – L. helveticus 842 (D) – 2 , 5 – L. casei subsp. rhamnosus М 536/12

Figure 1. Biocompatibility testing of Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48: 1 – Lactobacillus plantarum 314/7, 2 – L. plantarum 578/25, 3 – L. acidophilus 1660/15, 4 – L. helveticus 842 (D) – 2, 5 – L. casei subsp. rhamnosus M 536/12.

Аналогичным образом проводилось исследование по побору биосовместимых пар пропионовокислых бактерий. Биосовместимыми являются штаммы Propionibacterium freuden-reichii subsp. shermanii Ас-103/12 и Propionibac-terium shermanii К-16 . Выбор этих штаммов пропионовокислых бактерий обоснован тем, что они обладают доказанными пробиотическими свойствами, а штамм К-16 – активным продуцентом витамина В 12 .

Разработаны 2 варианта бактериальных ассоциаций, способные к совместному росту и развитию без проявления явлений антагонизма:

• •    Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48, Lactobacillus рlantarum 578/25, Propionibacte-ruim freudenreichii subsp. shermanii Ас-103/12, Propionibacterium shermanii К-16 (Ассоциация 1).

• •    Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48 и Lactobacillus helveticus 842 (D) – 2, Propionibac-teruim freudenreichii subsp. shermanii Ас-103/12, Propionibacteruim shermanii К-16 (Ассоциация 2).

Проведено совместное культивирование бактериальных ассоциаций с контролем за накоплением биомассы. Результаты представлены на рисунках 2 и 3.

Рисунок 2. Накопление биомассы ассоциациями молочнокислых и пропионовокислых бактерий 1 и 2 при культивировании на жидкой питательной среде MRS и одновременном внесении культур

Figure 2. Biomass accumulation by associations of lactic acid and propionic acid bacteria 1 and 2 when cultured on MRS liquid nutrient medium and simultaneous culture application

Время культивирования, ч

Cultivation time, h

Рисунок 3. Количество живых клеток пробиотических бактерий в культуральной жидкости на конец культивирования

Figure 3. Number of live cells of probiotic bacteria in the culture liquid at the end of cultivation

Установлено, что пропионовокислые бактерий необходимо вносить после 3–4 часов роста молочнокислых бактерий, соотношение культур 2:1, ферментацию ведут при периодическом перемешивании в анаэробных условиях при 37 °С и pH 5,9–6,0. Максимальный титр жизнеспособных клеток пробиотических бактерий в активной фазе роста, целесообразно получать на 18–20 часа роста. Посев культуральной жидкости смешанной культуры из разведения, показал плотность популяции, отсутствие доминирования одной культуры над другой и сохранение заданного соотношения штаммов в составе ассоциации.

Известно, что для лечебно-профилактического эффекта на организм и обеспечения условий для адгезии бактерий в кишечнике, их концентрация в сухих препаратах должна быть не менее 1010–1012 КОЕ/г препарата. Поэтому при накоплении биомассы бактерий в технологическом процессе следует учитывать 10–20%-ную гибель популяции в процессе сушки или концентрирования.

Обсуждение

Полученные в статье экспериментальные данные являются продолжением исследований по созданию многоштаммовых бактериальных консорциумов для пробиотических препаратов пищевого и кормового назначения [9]. Актуальность направления исследований по созданию новых высокоэффективных бактериальных ассоциаций подтверждают ряд авторов [1, 9].

В ранее опубликованных материалах [3, 12, 13–20] отмечается, что молочнокислые бактерии в ассоциации с пропионовокислыми бактериями положительно влияют на микрофлору кишечника и могут использоваться в симбиозе. Опубликованы работы, подтверждающие преимущество ассоциаций биологически совместимых штаммов бактерий перед монокультурами [6].

Обзор литературных данных свидетельствует о недостаточности сведений о характере межштаммовых взаимодействий молочнокислых и пропионовокислых бактерий и применении их в практику отбора штаммов в состав пробиотических ассоциаций.

Результаты изучения биосовместимости штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48 с Lactobacillus. рlantarum 578/25 и Lactobacillus helveticus 842 (D) – 2 , а также показатели роста ассоциаций и накопления биомассы являются оригинальными.

Заключение

Данное исследование свидетельствует о перспективе использования методики определения биосовместимости пробиотических штаммов для создания высокоэффективных ассоциаций молочнокислых и пропионовокислых бактерий, необходимых для разработки функциональных пищевых продуктов и кормовых добавок. Разработаны 2 ассоциации пробиотических бактерий с применением современных методов биотехнологии, таким образом задачи исследования выполнены.

Необходимыми стадиями разработки пробиотических ассоциаций являются: поиск новых высокоэффективных продуцентов, их генетическое типирование, поддержание активного состояния бактерий на конец времени ферментации, подбор защитных сред и режимов сушки для снижения уровня гибели бактерий, совершенствование выпускаемых форм препаратов.

Дальнейшие исследования будут проводится в направлении получения функциональных пищевых ингредиентов на основе полученных ассоциаций.

Автор выражает благодарность старшему научному сотруднику лаборатории биотехнологии органических кислот ВНИИПБТ, к.т.н. Куксовой Е.В. за помощь в проведении экспериментальных исследований. Исследования выполнены в рамках государственного задания РАН № FGMF-2022-0006.