Создание биомиметических материалов на основе поли (– 3 – гидроксибутирата) и гемина

RUSSIAN JOURNAL OF BIOMECHANICS

Биомиметические материалы – это материалы, которые повторяют структуры, создаваемые живой природой [1]. Такие структуры, в частности получаемые методом электроформования, всё чаще демонстрируют высокое сродство к тканям живых организмов, что делает их более привлекательными для решения задач биомедицины [2]. В связи с этим создание и исследование биомиметических композитов с улучшенными свойствами на основе биосовместимых полимеров является актуальной комплексной задачей.

Одним из наиболее интересных полимеров для решения такой задачи является полиэфир природного происхождения поли( - 3 - гидроксибутират) (П3ГБ) [2]. П3ГБ характеризуется высокой степенью кристалличности 50–60 %, гидрофильностью и высокой хрупкостью [3]. Однако биосовместимость, экологичность синтеза и температура стеклования от – 9 до – 4°С делает данный полимер привлекательным для применения в биорезорбируемых каркасах, имплантатах, системах доставки с контролируемым высвобождением. Низкая прочность, а также преобладание жесткой составляющей аморфной фазы делают привлекательной перспективу модификации полимера, а также разработку подходов к созданию гибких и пористых систем на основе П3ГБ, в том числе с применением метода электроформования [4–7]. Цель данной работы – оценка влияния гемина на свойства, структуру и скорость биодеградации П3ГБ в среде микробиоты (инокулят).

Объекты и методы исследования

Материалы

Для получения тонких нетканых материалов толщиной 100–110 мкм использовали биоразлагаемый полиэфир поли( - 3 - гидроксибутират) (П3ГБ), полученный методом микробиологического синтеза компанией Biomer (Германия) со средневязкостной молекулярной массой 510 кДа. Гемин был получен экстракцией из крови крупного рогатого скота компанией Aldrich Sigma (США) (рис. 1).

Получение нетканых материалов

Нетканые материалы получали методом электроформования. Раствор П3ГБ в хлороформе готовили в автоматической магнитной мешалке при постоянной температуре 60°С, раствор гемина в диметилсульфоксиде готовили в автоматической магнитной мешалке при постоянной температуре 24°С, затем растворы смешивали в пропорциях соответственно концентрациям гемина относительно массы полимера 0, 1, 3, 5 мас. %. Электроформование

Рис. 1. Структурная формула гемина осуществляли на однокапиллярной установке ЭФВ - 1 (ИБХФ РАН, Россия) при напряжении 17–20 кВ, расстоянии между электродами 200 мм, влажности 40 % и температуре 24°С. Материалы оставляли до полного высыхания в эксикаторе при 24°С и влажности 0 % до постоянного показателя массы, остаток растворителя контролировали методом инфракрасной спектроскопии.

Исследование морфологии и структуры

Изучение морфологии волокнистого слоя проводили методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с помощью электронного микроскопа Tescan VEGA (Чехия) в режиме обратного рассеяния при напряжении 20 кВ с напылением платины на поверхность образцов. Оптическую микроскопию проводили с помощью оптического микроскопа Micromed polar 3 ToupCam 5.1 MP «Микромед» (Россия) в проходящем свете, используя режим z - сканирования.

Исследование физико - механических свойств

Исследование физико - механических свойств проводили в условиях одноосного растяжения со скоростью 25 мм/мин с помощью универсальной испытательной машины DVT GP UG 5 Devotrans (Китай) в соответствии с ГОСТ Р 53226 - 2008.

По результатам испытаний проводились расчеты предела прочности и относительного удлинения материалов.

Исследование теплофизических свойств

Исследование         образцов         методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)

100 мкм

100 мкм

Рис. 2. СЭМ-микрофотографии поверхности нетканых материалов «П3ГБ – гемин», где: а – 0 %, б – 1%; в – 3 %; г – 5% гемина

осуществляли на приборе DSC Polyma 204 Nezsch (Германия) в атмосфере азота при скорости нагрева и охлаждения 10°К/мин. Размер кристаллитов (L) определялся по соответствующим дифрактограммам в соответствии с подходом Брэгга – Брентано с использованием формулы Селякова – Шеррера [8]. Дифрактограммы получали на на дифрактометре HZG4 Freiberger Prisionsmechanik (Германия).

Термогравиметрический анализ (ТГА) проводился на приборе TGA/DSC3 + Mettler Toledo (Швейцария) в атмосфере азота при скорости нагрева 10°К/мин.

Определение гидрофильности

Угол смачивания определялся на оптическом микроскопе с использованием программного обеспечения Altami studio 3.4 software при размере капли 2 мкл в 3 точках.

Исследование аморфной фазы

Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) вращения нитроксильного радикала 2,2,6,6 - тетраметилпиперидин - 1 - оксил (ТЕМПО) регистрировали на автоматизированном ЭПР - спектрометре ЭПР - В (ИБХФ РАН, Россия) [9]. Экспериментальные спектры вращения спинового зонда в аморфной фазе полимера в области медленных движений (τ > 10–9 с) анализировали с помощью программы NLSL по известной методике [10].

Оценка биодеградации

Для оценки биодеградации материалов в модельной среде использовали метод Штурма, который проводился в соответствие с ГОСТ 32427–2013 (Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды Определение биоразлагаемости: 28 - дневный тест)

в течение 56 суток согласно методу В. Степень биодеградации    определяли    по    количеству выделившегося в ходе экспонирования образцов в почвенном инокуляте CO2, связанного в растворе путем пропускания газа через раствор 0,0125 М Ba(OH)2 (ч.д.а., ООО «Русхим ру», Россия) , с помощью метода обратного кислотно - основного кондуктометрического титрования 0,05 М раствором HCl (х.ч., ООО «Экросхим», Россия) на аппарате автоматического титрования ТИТРИОН - 2 (ООО «Эконикс – Эксперт», Россия). Различие максимумов повторных величин разложения исследуемых веществ в конце эксперимента составляло менее 15 % по отношению к референтному веществу (натрия бензоат, который достигал порогового значения к 10 дню эксперимента). Данные условия являлись     критерием     достоверности     для использованного метода исследования.

Результаты

СЭМ - микрофотографии нетканых материалов на основе П3ГБ с различным содержанием гемина

Таблица 1

Энтальпия плавления ( ∆H пл ) и кристаллизации

(АНкр), температура плавления (Тпл), температура кристаллизации (Ткр) и температура стеклования (Тст) си- стем «ПГБ - гемин»

Концентрация гемина, %	Т ст , °С	Т пл , °С	∆H пл , Дж/г	Т кр , °С	АН кр , Дж/г
0	- 6	174,5	93,1	43	37
1	- 6	172,0	81,8	46	37
3	- 6	173,0	77,8	49	30
5	- 6	174,0	75,3	47	25

Таблица 2

Время корреляции (τ) нитроксильного радикала ТЕМПО в аморфной фазе П3ГБ, средний размер кри сталлитов (L020) и прочностные характеристики систем «П3ГБ - гемин»

Концентрация гемина, %	т, Ю"10 с	L 020 , нм	Прочность, МПа	Удлинение, %
0	45,0	41	1,7	3,6
1	75,0	48	1,7	4,7
3	85,0	46	1,9	4,7
5	95,0	45	5,5	6,1

Таблица 3

Характеристики термостойкости и смачиваемости систем «П3ГБ - гемин».

Концентрация гемина, % Тн, °С Тд, °С Несгораемый остаток, % 0 278,2 292 4,00 1 263,3 284 7,54 3 287,2 304 4,43 5 283,3 302 3,06 представлены на рис. 2. Хорошо видно, что с ростом концентрации гемина снижается число дефектов на поверхности волокон, уменьшаются средние диаметры волокон с 3,5 до 2,1 мкм в случае 1 мас.% гемина и до 1,8 мкм в случае 3 и 5 масс % гемина. Наблюдается уменьшение межволоконных расстояний с ростом концентрации гемина, а также изменение микрорельефа поверхности. Такие явления часто наблюдаются при введении в формовочные растворы малых концентраций частиц металлов или малых концентраций органических веществ, содержащих полярные группы, так как повышают электропроводность раствора [1 1–12]. Известно, что средний диаметр нановолокон уменьшается с ростом электропроводности [13].

В табл. 1 приведены теплофизические характеристики материалов, полученные методом ДСК. Снижение температуры плавления полимера, как правило, говорит о формировании менее совершенной надмолекулярной структуры, в частности менее крупных кристаллических структур, которые менее устойчивы к температурному воздействию и плавятся при более низких температурах [14]. Также наблюдается и снижение энтальпии плавления полимера, которое свидетельствует о снижении общей доли кристаллической фракции [15–17]. При этом по данным РСА было установлено, что средний продольный размер кристаллитов (L020) существенное возрастает при введении гемина с максимумом в 1 мас.% добавки (табл. 2). Такие кристаллиты в случае П3ГБ могут формироваться в присутствии нуклеирующих частиц – центров кристаллизации.

Известно, что П3ГБ характеризуется низкой степенью зародышеобразования [18]. Вероятно, частицы гемина могут ингибировать кристаллизацию, однако рост более крупных кристаллитов в условиях волокнообразования методом электроформования приводит и к формированию дефектов кристаллической структуры, которые снижают общую кристалличность и температуру плавления, приводят к формированию паракристаллических образований [19–23].

Структура аморфной фазы П3ГБ исследовалась методом ЭПР. В табл. 2 приведены значения времени корреляции спинового зонда, которые характеризуются подвижность зонда в аморфной фазе полимера. Добавки в зависимости от химической структуры могут локализоваться в различных областях аморфной фазы, иногда при формовании их раствора могут проявлять склонность к агрегации [22; 24–25]. Некоторые добавки могут локализоваться в свободном пространстве между цепями полимера, способствуя более плотной упаковке и более тесному сближению макромолекул в аморфных областях [26]. Это эффект, вероятно, наблюдается для систем «П3ГБ – гемин», так как метод ЭПР позволил зафиксировать рост времени корреляции зонда, что свидетельствует о более медленном вращении радикала в более плотной аморфной фазе. Кроме того, видно, что рост концентрации гемина способствует линейному увеличению плотности аморфной фазы. Как правило, увеличение рыхлости аморфной фазы, то есть рост свободного объема в пространстве между макромолекулами, может приводить к снижению прочности и росту эластических свойствах системы [27–30]. В системы «П3ГБ – гемин» хорошо видно, что прочность материала существенно растет при введении добавки, но также увеличивается и удлинение материала. Вероятно, заметный рост прочностных характеристик связан не только с более плотной упаковкой цепей полимера в аморфной фазе и формированием более крупных кристаллитов, но и с улучшением морфологии волокон. Как было отмечено ранее, введение гемина и сопутствующее увеличение электропроводности привело к уменьшению средних диаметров, снижению числа дефектов и уменьшению межволоконного пространства, а следовательно, к формированию более равномерного материала, который может выдерживать большие нагрузки.

Известно, что механизм разрушения нетканых

Рис. 3. Кривые ТГА образцов с различным содержанием гемина

Рис. 4. Изменение краевого угла смачивания в зависимости от концентрации гемина, град.

Рис. 5. Кривые потери массы образцов с различным содержанием гемина

материалов, полученных методом электроформования, представлен основными стадиями: (1) переориентация отдельных, наиболее подвижных волокон в системе; (2) нагружение системы до разрыва наиболее прочных осевых волокон, которые удерживают всю структуру [31]. Механические свойства индивидуальных волокон в значительной степени определяются наличием дефектов (утолщений, склеек, разрывов), некоторыми параметрами надмолекулярной организации, включая анизотропию, ориентацию в аморфной фазе, а также химической структурой [30–33]. Таким образом, вероятно, что введение гемина, в особенности 5 мас.%, обеспечивает улучшение морфологии, формирующее устойчивость к нагрузкам на первом этапе у более равномерных и хорошо отвержденных волокон, а также более высокую устойчивость отдельных волокон за счет улучшения надмолекулярной структуры на втором этапе.

Характеристики термостойкости материалов приведены в табл. 3. Введение гемина приводит к нелинейному изменению как начала эффекта (Тн), так и температуры деструкции (Тд). Добавление 1 мас.% гемина приводит к значительному отличию термофизических свойств П3ГБ. В то время как 3 мас.% приводят к максимуму температуры деструкции выше, чем у исходного материала, на 9°С. Считается, что рост температуры деструкции полимерного композита в присутствии наполнителя может быть обусловлен релаксацией полимерных цепей, что также способствует снижению механических свойств композита [19]. Интересно, что для 1 мас.% доля несгораемого остатка значительно превышала расчетные значения, что могло свидетельствовать об образовании несгораемых углеродных структур в присутствии добавки [20], однако следует отметить особенность кривой потери массы 1 % (рис. 3). Кривая имеет нехарактерный двухстадийным характер, где первая стадия потери массы составляет 4 % и происходит в диапазоне 50–70°С. Как правило, в этом температурном диапазоне потеря массы обусловлена испарением физически адсорбированной влаги или испарением остаточного растворителя, однако растворитель, вероятно, обнаруживался бы для всех образцов. Следовательно, можно говорить об адсорбированной влаге. Сами полимерные цепи обычно термически стабильны при таких низких температурах и не начинают разлагаться. В табл. 3 приведен также угол смачивания для систем «П3ГБ – гемин». Хорошо видно, что введение гемина приводит к снижению угла смачивания материала (рис. 4). Стоит отметить, что максимум обнаруживается для 1 мас.% гемина, что может объяснять отличия кривых ТГА и двухстадийный характер для 1 мас.% гемина.

На рис. 5 показаны кривые потери массы материалов. Динамика потери массы в инокуляте коррелирует с полученными данными о строении надмолекулярной структуры и характером гидрофильности. Все материалы, содержащие гемин, демонстрируют замедленную потерю массы в сравнении с чистым П3ГБ, что может быть обусловлено изменением в надмолекулярной структуре и снижением доступности ее для проникновения деструкторов в объем. Интересно, что все образцы «П3ГБ – гемин» имеют характерный участок кривой биодеградации в период 0–30 дней, когда биодеградация идет интенсивнее, чем у чистого П3ГБ, однако после 30 дней потеря массы замедляется, в то время, как у П3ГБ масса расходуется более линейно и равномерно на всем промежутке времени доходя до 90 %. При сравнении различных концентраций ге-мина в системе «П3ГБ – гемин» видно, что, несмотря на наличие более крупных кристаллических структур в случае 1 мас.% гемина, которые наиболее устойчивы к разрушению микробиотой, решающим оказывается фактор большего свободного объема в аморфной фа-зе и более высокой гидрофильности

Обсуждение

Полученные результаты согласуются с современными представлениями о влиянии низкомолекулярных добавок и соединений с полярными группами на структуру и свойства поли(- 3 - гидроксибутирата). Ранее показано, что введение порфиринсодержащих соединений и других полярных компонентов в системы на основе П3ГБ может приводить к изменению морфологии волокон и снижению их среднего диаметра за счет увеличения электропроводности формовочного раствора [11–13]. В настоящей работе аналогичный эффект проявляется в уменьшении диаметра волокон с 3,5 до 1,8 мкм при увеличении содержания гемина.

Снижение энтальпии плавления и температуры плавления при введении гемина согласуется с данными других авторов, наблюдавших уменьшение степени кристалличности П3ГБ при введении добавок, способных нарушать регулярность упаковки макромолекул [14]. Однако в отличие от ряда работ, где добавки приводят к ухудшению механических характеристик, в данной системе наблюдается одновременное увеличение прочности (с 1,7 до 5,5 МПа) и относительного удлинения (с 3,6 до 6,1 %). Это может быть связано с комплексным влиянием гемина на морфологию волокон и надмолекулярную структуру, включая формирование более равномерной волокнистой сети и уплотнение аморфной фазы.

Рост времени корреляции спинового зонда, зафиксированный методом ЭПР, свидетельствует об уменьшении подвижности макромолекул в аморфной фазе, что также согласуется с работами, в которых показано уплотнение аморфных областей при введении низкомолекулярных добавок [22; 24–25]. В отличие от этих исследований, в данной работе продемонстрировано, что подобное уплотнение не приводит к снижению деформационной способности материала, а сопровождается ростом удлинения при разрыве.

Особый интерес представляет влияние гемина на биодеградацию материалов. В ряде исследований отмечается, что снижение кристалличности должно ускорять деградацию полимеров за счет увеличения доступности аморфных областей [9; 11, 34–37]. Однако в настоящей работе показано, что после 30 суток экспозиции материалы с гемином деградируют медленнее, чем чистый П3ГБ. Это расхождение может быть объяснено формированием более плотной аморфной фазы и изменением гидрофильности системы, что ограничивает диффузию микроорганизмов и ферментов в объем материала.

Таким образом, в отличие от ранее опубликованных данных, получено, что введение гемина оказывает комплексное влияние на структуру и свойства П3ГБ, обеспечивая одновременное улучшение механических характеристик и снижение скорости биодеградации на поздних стадиях. Это делает такие системы перспективными для применения в биомедицинских материалах с контролируемыми функциональными свойствами.

Заключение

Полученные результаты позволяют интерпретировать роль гемина в процессе формировании надмолекулярной структуры П3ГБ при получении нетканых волокнистых материалов. Благодаря высокой полярности молекулы, гемин образует межмолекулярные связи с карбонильными и гидроксильными группами ПГБ, благодаря чему снижается его степень кристалличности и растет время корреляции, характеризующее уплотнение аморфных областей полимера. Высокий уровень межмолекулярного взаимодействия гемина с полимерными макроцепями приводит к росту прочностных характеристик. При этом наблюдается снижение гидрофобности и скорости потери массы материала в бактериальной суспензии. Полученные результаты открывают перспективы для дальнейшей