Создание дигаплоидных линий Brassica napus L. — доноров устойчивости к вирусу мозаики турнепса
Автор: Зубарева И.А., Головешкина Е.Н., Виноградова С.В., Грибова Т.Н., Монахос С.Г., Игнатов А.Н.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Краткие сообщения
Статья в выпуске: 5 т.48, 2013 года.
Бесплатный доступ
Интерес к рапсу обусловлен его использованием для получения биотоплива, потребностью в растительных маслах и высокобелковых кормах. Однако при этом не решена проблема устойчивости культуры к вирусу мозаики турнепса ( Turnip mosaic virus — TuMV), вызывающему большие потери. Получение устойчивых форм — единственный и экологически безопасный способ борьбы с этим вирусом. Мы изучили устойчивость растений к шести генетически полиморфным изолятам вируса мозаики турнепса TuMV в коллекции из 64 образцов хозяйственно ценных и диких представителей рода Brassica — растений видов B. napus, B. rapa, B. oleracea и B. juncea. По результатам визуальной оценки развития симптомов мозаики и количественного иммуноферментного анализа выявлено 24 наиболее перспективных образца, обладающих устойчивостью ко всем изолятам TuMV (13 образцов) и к 5 из 6 изолятов (11 образцов). После этого через культуру микроспор от устойчивых форм получали гаплоидные растения. Для 12 устойчивых образцов подобраны условия тепловой обработки для стимуляции эмбриогенеза и получены удвоенные гаплоидные линии — доноры устойчивости к TuMV.
Культура микроспор, удвоенные гаплоиды
Короткий адрес: https://sciup.org/142133439
IDR: 142133439
Текст научной статьи Создание дигаплоидных линий Brassica napus L. — доноров устойчивости к вирусу мозаики турнепса
Получение гаплоидов и дигаплоидов через культуру пыльников и микроспор в настоящее время стало общепризнанным методом в селекции устойчивых к патогенам гомозиготных линий растений для создания новых сортов и гибридов (6). Изолированные микроспоры при оптимальном сочетании условий культивирования и стрессов могут перейти от нормального гаметофитного пути развития к спорофитному, а затем производить эмбриоиды и гаплоидные или удвоенные гаплоидные растения (7). Выращивание растений из микроспор часто используют в селекции и фундаментальных исследованиях.
Наша цель заключалась в оценке коллекции из различных представителей рода Brassica на устойчивость к TuMV и получении дигаплоидных линий масличного рапса — доноров устойчивости к вирусу.
Методика . Были использованы растения семейства Brassicaceae , полученные из коллекций Всероссийского НИИ растениеводства (г. Санкт-
Петербург), Всероссийского научно-исследовательского и проектно-технологического института рапса (г. Липецк) и Центра «Биоинженерия» РАН (всего 64 образца хозяйственно ценных и диких видов B . napus , B . nigra , B . rapa , B . oleracea и B . juncea ).
Все исследуемые образцы в 4-кратной повторности механически инокулировали (8) 6 изолятами TuMV, выделенными из пораженных растении B . oleracea (изолят I2), B . rapa subsp. rapa (I3a), B . napus (I3b), выращенных в защищенном грунте, и из полевой культуры B . rapa subsp. chinensis (I7, I8, I10). Для оптимального инфицирования и развития (распространения) вирусной инфекции в растениях в экспериментальной установке искусственного климата поддерживали температуру 23-25 °C.
Симптомы заболевания оценивали визуально по двум 10-балльным шкалам каждые 7 сут в течение 4 нед после инокуляции, затем в растениях определяли содержание TuMV с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) в модификации Double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) с использованием поликлональных антител к TuMV (тест-система «Neogen Corporation», США) согласно протоколу производителя.
Для изоляции микроспор из пыльников и получения жидкой культуры применяли питательную среду NLN-13 (9) с добавлением L-серина (0,1 г/л), L-глютамина (0,8 г/л), глютатиона (0,03 г/л) и 13 % сахарозы (рН 6,1). Бутоны размером 2,5-3,5 мм обеззараживали в 70 % этиловом спирте в течение 3 мин, трижды отмывали в стерильной дистиллированной воде (по 5 мин), гомогенизировали до однородной массы и фильтровали через нейлоновую мембрану с диаметром пор 0,4 мкм. NLN-средой доводили объем смеси из расчета 1 мл среды на 1 бутон и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин. Надосадочную жидкость сливали и процедуру повторяли еще дважды (10). Суспензионную культуру разливали по 5-6 мл в чашки Петри (d = 10 см). Для индукции эмбриогенеза изолированную культуру микроспор подвергали тепловому шоку при 32, 33 и 35 °C в течение 24, 48 и 72 ч. Далее микроспоры культивировали при 25 °C. Через 21 сут образовавшиеся эмбриоиды переносили на плотную питательную среду MS (11), на которой проходило формирование семядольных листьев и корневой системы. Через 3 нед культивирования на плотной среде хорошо развитые проростки адаптировали к почвенным условиям и выращивали до стадии формирования 3-4 настоящих листьев. После подсчета числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц для проверки плоидности растений (12) во все пазушные почки инъецировали 0,2 % раствор колхицина с целью удвоения числа хромосом (13).
Резуёътаты . При оценке устойчивости в коллекции растений рода Brassica были обнаружены различия в чувствительности образцов к изоля-там TuMV (табл.) и в проявляемых симптомах заболевания. При заражении изолятом I2 наблюдали хлоротичную пятнистость (0-8 баллов), морщинистость листьев (от 0 до 4 баллов), угнетение роста и развития растений; изолятом I3a — хлоротичную пятнистость (0-6 баллов), морщинистость листьев (0-3 балла); I3b — хлоротичную пятнистость (0-9 баллов), морщинистость листьев (0-5 баллов), угнетение роста и развития. Изоляты I7, I8 и I10 вызывали хлороз листьев (4-7 баллов). ИФА подтвердил результаты визуальной оценки и выявил дополнительно три толерантных (бессимптомных) пары вирус—растение (изолят I2 c образцами B . nigra № 12, Cobra line 1.8 и STS К у ).
Всего было отобрано 13 образцов (№ 444, Центр-1, № 1, № 417, Jp-8, Ханна, Jp-4, Центр-2.1, Гриффин, Галант, Луговской, Cobra SR и ISA454.1 B . oleracea ) с устойчивостью ко всем 6 изолятам TuMV и еще 11
(Оро, Jp-2, Cobra Winter, Центр-2.2, № 417.1.1, Jp-1, Гриффин DR, Гриффин CR, FH1 B . oleracea , ISA454.1.36 B . oleracea , B . nigra № 12) с резистентностью к 5 изолятам (I2, I3a, I7, I8 и I10). Устойчивые ко всем изучаемым изолятам образцы в дальнейшем использовали для получения удвоенных гаплоидных линий — доноров устойчивости к TuMV через культуру микроспор.
Устойчивость изученных образцов Brassica к изолятам вируса мозаики турнепса TuMV при искусственном заражении
Для каждого образца были подобраны условия тепловой стимуляции. Так, при воздействии температурой 32 оС в течение 72 ч получили эмбриоиды четырех образцов B . napus — № 444, Jp-8, Ханна и Jp-4; в варианте 33 оС/72 ч — № 1, № 417, Луговской и Гриффин; 35 °С/24 ч — Cobra SR, Центр-1 и Центр-2.1, 32 °С/48 ч — ISA454.1 B . oleracea .
После переноса сформированных эмбриоидов на плотную питательную среду, адаптации и обработки колхицином отобрали 12 дигапло-идных форм (чистые линии), которые могут использоваться как доноры устойчивости к 6 изученным изолятам TuMV.
Таким образом, на основе исследования устойчивости коллекционных образцов Brassica к различным изолятам вируса мозаики турнепса TuMV через культуру микроспор получены гаплоидные линии, а после их обработки колхицином — удвоенные гаплоидные линии для использования в селекции в качестве доноров устойчивости к TuMV.
