Создание дигаплоидных линий Brassica napus L. — доноров устойчивости к вирусу мозаики турнепса
Автор: Зубарева И.А., Головешкина Е.Н., Виноградова С.В., Грибова Т.Н., Монахос С.Г., Игнатов А.Н.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Краткие сообщения
Статья в выпуске: 5 т.48, 2013 года.
Бесплатный доступ
Интерес к рапсу обусловлен его использованием для получения биотоплива, потребностью в растительных маслах и высокобелковых кормах. Однако при этом не решена проблема устойчивости культуры к вирусу мозаики турнепса ( Turnip mosaic virus — TuMV), вызывающему большие потери. Получение устойчивых форм — единственный и экологически безопасный способ борьбы с этим вирусом. Мы изучили устойчивость растений к шести генетически полиморфным изолятам вируса мозаики турнепса TuMV в коллекции из 64 образцов хозяйственно ценных и диких представителей рода Brassica — растений видов B. napus, B. rapa, B. oleracea и B. juncea. По результатам визуальной оценки развития симптомов мозаики и количественного иммуноферментного анализа выявлено 24 наиболее перспективных образца, обладающих устойчивостью ко всем изолятам TuMV (13 образцов) и к 5 из 6 изолятов (11 образцов). После этого через культуру микроспор от устойчивых форм получали гаплоидные растения. Для 12 устойчивых образцов подобраны условия тепловой обработки для стимуляции эмбриогенеза и получены удвоенные гаплоидные линии — доноры устойчивости к TuMV.
Культура микроспор, удвоенные гаплоиды
Короткий адрес: https://sciup.org/142133439
IDR: 142133439 | УДК: 633.853.494:632.938.1:578.864:57.085.23
The development of turnip mosaic virus resistant doubled haploid lines of Brassica napus L
Oilseed rape is a valuable crop used for biodiesel, vegetable oil and high-protein animal feed. However, there is a need for cultivars resistant to turnip mosaic virus (TuMV), which causes a great losses. Resistant plants are the only efficient and environmentally safe way to control this virus. We have studied the resistance in collection of 64 accessions of cultivated and wild brassicas ( Brassica napus, B. rapa, B. oleracea and B. juncea to six genetically different isolates of TuMV. Assessment of visual mosaic symptoms and quantitative ELISA test identified 24 most promising accessions that were resistant to all isolates of TuMV (13 accessions) and 5 of 6 isolates (11 accessions). Then, the haploid resistant plants were obtained using microspore culture. An optimal condition of high temperature treatment to induce embryogenesis were found for 12 accessions, and doubled haploid lines, the donors of resistance to TuMV, were propagated.
Текст научной статьи Создание дигаплоидных линий Brassica napus L. — доноров устойчивости к вирусу мозаики турнепса
Получение гаплоидов и дигаплоидов через культуру пыльников и микроспор в настоящее время стало общепризнанным методом в селекции устойчивых к патогенам гомозиготных линий растений для создания новых сортов и гибридов (6). Изолированные микроспоры при оптимальном сочетании условий культивирования и стрессов могут перейти от нормального гаметофитного пути развития к спорофитному, а затем производить эмбриоиды и гаплоидные или удвоенные гаплоидные растения (7). Выращивание растений из микроспор часто используют в селекции и фундаментальных исследованиях.
Наша цель заключалась в оценке коллекции из различных представителей рода Brassica на устойчивость к TuMV и получении дигаплоидных линий масличного рапса — доноров устойчивости к вирусу.
Методика . Были использованы растения семейства Brassicaceae , полученные из коллекций Всероссийского НИИ растениеводства (г. Санкт-
Петербург), Всероссийского научно-исследовательского и проектно-технологического института рапса (г. Липецк) и Центра «Биоинженерия» РАН (всего 64 образца хозяйственно ценных и диких видов B . napus , B . nigra , B . rapa , B . oleracea и B . juncea ).
Все исследуемые образцы в 4-кратной повторности механически инокулировали (8) 6 изолятами TuMV, выделенными из пораженных растении B . oleracea (изолят I2), B . rapa subsp. rapa (I3a), B . napus (I3b), выращенных в защищенном грунте, и из полевой культуры B . rapa subsp. chinensis (I7, I8, I10). Для оптимального инфицирования и развития (распространения) вирусной инфекции в растениях в экспериментальной установке искусственного климата поддерживали температуру 23-25 °C.
Симптомы заболевания оценивали визуально по двум 10-балльным шкалам каждые 7 сут в течение 4 нед после инокуляции, затем в растениях определяли содержание TuMV с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) в модификации Double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) с использованием поликлональных антител к TuMV (тест-система «Neogen Corporation», США) согласно протоколу производителя.
Для изоляции микроспор из пыльников и получения жидкой культуры применяли питательную среду NLN-13 (9) с добавлением L-серина (0,1 г/л), L-глютамина (0,8 г/л), глютатиона (0,03 г/л) и 13 % сахарозы (рН 6,1). Бутоны размером 2,5-3,5 мм обеззараживали в 70 % этиловом спирте в течение 3 мин, трижды отмывали в стерильной дистиллированной воде (по 5 мин), гомогенизировали до однородной массы и фильтровали через нейлоновую мембрану с диаметром пор 0,4 мкм. NLN-средой доводили объем смеси из расчета 1 мл среды на 1 бутон и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин. Надосадочную жидкость сливали и процедуру повторяли еще дважды (10). Суспензионную культуру разливали по 5-6 мл в чашки Петри (d = 10 см). Для индукции эмбриогенеза изолированную культуру микроспор подвергали тепловому шоку при 32, 33 и 35 °C в течение 24, 48 и 72 ч. Далее микроспоры культивировали при 25 °C. Через 21 сут образовавшиеся эмбриоиды переносили на плотную питательную среду MS (11), на которой проходило формирование семядольных листьев и корневой системы. Через 3 нед культивирования на плотной среде хорошо развитые проростки адаптировали к почвенным условиям и выращивали до стадии формирования 3-4 настоящих листьев. После подсчета числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц для проверки плоидности растений (12) во все пазушные почки инъецировали 0,2 % раствор колхицина с целью удвоения числа хромосом (13).
Резуёътаты . При оценке устойчивости в коллекции растений рода Brassica были обнаружены различия в чувствительности образцов к изоля-там TuMV (табл.) и в проявляемых симптомах заболевания. При заражении изолятом I2 наблюдали хлоротичную пятнистость (0-8 баллов), морщинистость листьев (от 0 до 4 баллов), угнетение роста и развития растений; изолятом I3a — хлоротичную пятнистость (0-6 баллов), морщинистость листьев (0-3 балла); I3b — хлоротичную пятнистость (0-9 баллов), морщинистость листьев (0-5 баллов), угнетение роста и развития. Изоляты I7, I8 и I10 вызывали хлороз листьев (4-7 баллов). ИФА подтвердил результаты визуальной оценки и выявил дополнительно три толерантных (бессимптомных) пары вирус—растение (изолят I2 c образцами B . nigra № 12, Cobra line 1.8 и STS К у ).
Всего было отобрано 13 образцов (№ 444, Центр-1, № 1, № 417, Jp-8, Ханна, Jp-4, Центр-2.1, Гриффин, Галант, Луговской, Cobra SR и ISA454.1 B . oleracea ) с устойчивостью ко всем 6 изолятам TuMV и еще 11
(Оро, Jp-2, Cobra Winter, Центр-2.2, № 417.1.1, Jp-1, Гриффин DR, Гриффин CR, FH1 B . oleracea , ISA454.1.36 B . oleracea , B . nigra № 12) с резистентностью к 5 изолятам (I2, I3a, I7, I8 и I10). Устойчивые ко всем изучаемым изолятам образцы в дальнейшем использовали для получения удвоенных гаплоидных линий — доноров устойчивости к TuMV через культуру микроспор.
Устойчивость изученных образцов Brassica к изолятам вируса мозаики турнепса TuMV при искусственном заражении
Для каждого образца были подобраны условия тепловой стимуляции. Так, при воздействии температурой 32 оС в течение 72 ч получили эмбриоиды четырех образцов B . napus — № 444, Jp-8, Ханна и Jp-4; в варианте 33 оС/72 ч — № 1, № 417, Луговской и Гриффин; 35 °С/24 ч — Cobra SR, Центр-1 и Центр-2.1, 32 °С/48 ч — ISA454.1 B . oleracea .
После переноса сформированных эмбриоидов на плотную питательную среду, адаптации и обработки колхицином отобрали 12 дигапло-идных форм (чистые линии), которые могут использоваться как доноры устойчивости к 6 изученным изолятам TuMV.
Таким образом, на основе исследования устойчивости коллекционных образцов Brassica к различным изолятам вируса мозаики турнепса TuMV через культуру микроспор получены гаплоидные линии, а после их обработки колхицином — удвоенные гаплоидные линии для использования в селекции в качестве доноров устойчивости к TuMV.
