Создание консорциума пробиотических микроорганизмов с высокой биохимической активностью и экзополисахаридным потенциалом

Производство пробиотических молочных продуктов, сохраняющих стабильные показатели качества при хранении, является одной из важнейших задач пищевой промышленности. Интенсивное расширение ассортимента продуктов привело к использованию в тeхнологии пищевых добавок. Для улучшения реологических характериcтик и увеличения срока годности примeняют стабилизаторы, консерванты и антиоксиданты различного происхождения. Однако до послeднего времeни не решены все аспекты биобезопасности, возникающие при использовании в производстве продуктов питания пищевых добавок.

В последние годы за рубежом внимание акцентируется на новых стартовых культурах, синтезирующих экзополисахариды, которые не только являются натуральной альтернативой пищевым добавкам, улучшающим реологические показатели пищевых продуктов, но и выступают в роли факторов, способствующих адгезии полезных микроорганизмов на стенках кишечника. Особый интерес к ЭПC-активным культурам пробиотических микроорганизмов обусловлен тем, что на международном уровне молочнокислым и бифидобактериям присвоен высокий статус безопасности, что подтверждает возможность применения ЭПC-продуцирующих штаммов этих микроорганизмов в производстве безопасных продуктов питания.

Целью работы является разработка бактериального концентрата для производства пробиотической сметаны с стабильными качественными характеристиками

Объекты и методы исследований

Объектами исследований служили чистые культуры пробиотических бактерий: штамм Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii AC-2503 , полученный из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (Москва), штаммы бифидобактерий Bifidobacterium longum DK 100 , Bifidobacterium bifidum 8 3 , Bifidobacterium longum B379M , активизированные уникальным биотехнологическим методом, разработанным в ВСГУТУ, и штаммы молочнокислых бактерий Lactococcus lactis subsp. cremoris 18П, Lactococcus lactis subsp. cremoris 24 4 , Lactococcus lactis subsp. cremoris T-18-20 , полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика».

Для культивирования пробиотических микроорганизмов применяли питательную среду на основе осветленной сыворотки с внесением ростовых компонентов, разработанную в ВСГУТУ.

Для определения стандартных показателей применяли методики, регламентируемые ГОСТ. Количественное определение экзополисахаридов – колориметрическим фенол-кислотным методом; рост биомассы фотоколориметрическим методом на спектрофотометре PD-101 APEL при λ=550 нм; количественный учет бифидобактерий и пропионовокислых бактерий – по МУК 4.2.999-00.

Результаты и их обсуждение

Отбор штаммов по производственно-ценным свойствам важный аспект разработки пробиотического продукта. На начальном этапе исследований был изучен биотехнологический потенциал пробиотических микроорганизмов. При выборе штаммов учитывали стабильность технологических и функциональных свойств, таких как органолептические свойства, способность к накоплению биомассы, способность к образованию вязких сгустков посредством синтеза экзополисахаридов, а также соответствие критериям, предъявляемым к пробиотическим микроорганизмам. Консистенция один из определяющих показателей качества сметаны. Поэтому при отборе культур для комбинированной закваски необходимо изучить степень продуцирования полисахаридов исследуемыми штаммами. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Полисахаридный потенциал микроорганизмов

Объект исследования	Относительная вязкость культуральной жидкости, сСт	Концентрация полисахаридов, мкг/см3
P. freundenreichii subsp. freundenreichiiАС-2500	1,88	19,70±0,61
P. cyclohexanicum kusano АС-2560	3,86	29,60±0,43
P. freudenreichii subsp. schermaniiАС- 2503	4,45	30,2±0,26
Bifidobacterium longum DK -100	1,92	5,9±0,04
Bifidobacterium bifidum 83	2,41	7,8±0,021
Bifidobacterium longum В379 М	2,4	7,5±0,03
Lactococcus lactis subsp. cremoris 244	4,62	23,8±0,21
Lactococcus lactis subsp. cremoris 18П	4,45	18,3±0,17
Lactococcus lactis subsp. cremoris Т-18-20	4,57	19,6±0,31

Наибольшую способность к продуцированию экзополисахаридов обнаружили штаммы Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii АС- 2503, Bifidobacterium bifidum 8 3 и Lactococcus lactis subspecies cremoris 24 4 .

Биотехнологический потенциал штаммов пробиотических бактерий, выбранных в консорциум комбинированной закваски, представлен в таблице 2.

Как видно из данных таблицы 2, заквасочные культуры активно ферментируют молоко с образованием сгустков с хорошими органолептическими свойствами. Совокупность полу- ченных результатов показывает, что изученные штаммы обладают высоким потенциалом жизнеспособности в желудочно-кишечном тракте, сохраняя при этом ферментативную активность.

Таблица 2

Биотехнологический потенциал пробиотических микроорганизмов

Показатели	L. cremoris 244	B. bifidum 83	P. shermanii АС-2503
Внешний вид и консистен-	однородная	однородная	однородная густая
ция	плотная вязкая	в меру жидкая	в меру вязкая
	чистый кисломолоч-	чистый нежный,	чистый кисломолочный
Вкус и аромат	ный, нежный сливочный привкус	кисломолочный	слегка пряный
Активность ферментации, ч	10-12	12-14	12-14
Кислотность, титруемая, 0Т	74±2	67±2	72±2
активная, рН	4,92±0,03	4,98±0,02	4,95±0,01
Титр жизнеспособных клеток, КОЕ./см3	6*109	4*109	5*109
Рост клеток при 20% желчи	+	+	+
40% желчи	±	+	±
4% NaCl	±	+	+
pH=4,5	+	+	+
Устойчивость к фенолу	+	+	+
Продуцирование
экзополисахаридов, мкг/см3	23,8±0,64	7,8±0,12	30,2±1,04
Индекс адгезивности микроорганизма	4,28±0,15	4,22±0,21	5,4±0,09

В результате исследований установлено, что подобранные культуры пробиотических микроорганизмов удовлетворяют всем критериям пригодности и являются перспективными для использования в составе комбинированной закваски для производства кисломолочных биопродуктов.

При создании консорциума бифидо-, лакто- и пропионовокислых бактерий необходимо подобрать оптимальные параметры культивирования, при которых будет наблюдаться взаимное стимулирование, сбалансированный рост и стабильное равновесие культур, а также сохранение производственно-ценных свойств каждого представителя микробной ассоциации. Сложность составления консорциума заквасочных культур в данном случае заключается в том, что культуры, составляющие конструкцию закваски, нуждаются в различных температурных оптимумах и обладают неодинаковым темпом размножения. Оптимальное соотношение микроорганизмов в консорциуме выбирали с учетом сбалансированного роста культур и органолептических показателей сгустков. Полученные результаты свидетельствуют о том, что сбалансированный рост всех микроорганизмов наблюдается при соотношении B.Bifidum 8 3 ,,L.Cremoris 24 4 :P.Shermanii АС-2503 , равном 40:30:30. При этом сгусток характеризуется однородной в меру вязкой консистенцией и высокими органолептическими показателями. О хорошей сочетаемости и прочных симбиотических отношениях свидетельствует высокая плотность популяций культур, гарантирующая стабильность микробного консорциума.

Подобранные условия культивирования консорциума пробиотических микроорганизмов обеспечивают высокую биохимическую активность и хорошие органолептические показатели инокулята.

Закваски являются основополагающим фактором качества в производстве сметаны. Именно закваски придают продукту большинство характерных особенностей вязкость, структуру сгустка, консистенцию, аромат, а также определяют стабильность качественных показателей при хранении. Структура и консистенция кисломолочных продуктов в значительной степени зависят от способности заквасочных культур продуцировать внеклеточные полисахариды. Согласно литературным данным, синтез и качественный состав экзометаболитов бактерий зависят от условий культивирования. Известно, что при культивировании бифидобактерий и пропионовокислых бактерий на питательной среде с добавлением селенита натрия повышается вязкость культуральной жидкости и увеличивается концентрация эк-зополисахаридов [1, 3]. Что касается лактококков, то такая информация в литературе отсутствует. Поэтому на следующем этапе было изучено влияние различных доз селенита натрия на биосинтез ЭПС пробиотическими микроорганизмами. Результаты исследований представлены на рисунке 1.

Таблица 3 Качественная характеристика инокулята

Показатели	Характеристика
Консистенция и внешний вид	однородная, в меру вязкая, плотная
Вкус и аромат	нежный, чистый, кисломолочный
Активность ферментации, ч	10-12
Кислотность, T	70-72
Количество жизнеспособных клеток B. Bifidum 8 3 , КОЕ/см3	5*109
Количество жизнеспособных клеток L. Cremoris 244 , КОЕ/см3	3*109
Количество жизнеспособных клеток P. Shermanii , КОЕ/см3	4*109
Содержание ЛЖК, мг/100 г	3,8

Как видно из данных, представленных на рисунке 1, добавление селенита натрия в питательную среду стимулирует синтез экзополисахаридов. Наибольший прирост экзополиса-харидов наблюдается в интервале концентраций селенита натрия от 10 до 30 мкг/см3. Дальнейшее увеличение концентрации селенита до 50 мкг/см3 не приводит к значительному повышению экзополисахаридов. Интересным является тот факт, что повышение концентрации селенита натрия в питательной среде не приводит к задержке роста микроорганизмов, и количество жизнеспособных клеток в конце культивирования составляет (1010-1011) КОЕ/см3.

концентрация селенита натрия, мкг/мл

1-B.Bifidum 8 3

—■— 2-L.Cremoris 24 4

3-P.Shermanii

Рис 1. Влияние селенита натрия на биосинтез экзополисахаридов

Это свидетельствует о высокой устойчивости микроорганизмов к селениту натрия. Устойчивость к селену бактерий может быть обусловлена наличием ассоциированных с клетками полисахаридов, препятствующих проникновению селена в клетки, которые затем высвобождаются в среду. Из литературных источников известно о защитных биологических функциях ЭПС микроорганизмов, которые играют главную защитную роль, поскольку действуют гораздо быстрее по сравнению с индуцибельными системами защиты [2, 4].

В результате проведенных исследований выбрана оптимальная доза селенита натрия 30 мкг/см3, обеспечивающая высокое количество экзополисахаридов и активный рост микроорганизмов.

В дальнейших исследованиях изучали рост биомассы и синтез ЭПС при совместном культивировании B. Bifidum 8 3 , L. Cremoris 24 4 и P. Shermanii АС-2503, взятых в соотношении 40:30:30 на питательной среде с добавлением селенита натрия в количестве 30 мкг/см³. Результаты исследований представлены на рисунке 2.

продолжителньость культивирования,ч

□ B. Bifidum 8 3  □ L. Cremoris 24 4

^ P. Shermanii

0  4  8  12 16 20 24

продолжительность культивирования,ч

—■— Оптическая плотность, О.Е.Д.

-л— ЭПС,мкг/мл а накопление биомассы и экзополисахаридов

б динамика роста культур комбинированной закваски

Рис 2. Влияние селенита натрия на накопление биомассы и синтез экзополисахаридов культурами консорциума

Как видно из данных, представленных на рисунке 2, синтез экзополисахаридов культурами комбинированной закваски начинается на ранних стадиях роста и продолжается в течение всего периода культивирования, максимальное количество экзополисахаридов отмечено в стационарной фазе роста и составляет 39,6 мкг/см3.

При совместном культивировании культур B. Bifidum 8 3 , L. Cremoris 24 4 и P. Shermanii АС-2503 на питательной среде с селенитом натрия отмечен сбалансированный рост микроорганизмов и количество жизнеспособных клеток через 20 ч культивирования составляет (10¹⁰-10¹¹) КОЕ/см³.

Следует отметить, что экзополисахариды играют важную роль в формировании симбиотических систем. Так, данные, имеющиеся в литературе, свидетельствуют о том, что узнавание и первичные контакты симбионтов происходят благодаря взаимодействию полисахаридов клеточной поверхности бактерий, которые обеспечивают высокую адаптационную, физиологическую устойчивость клеток микроорганизмов.

Заключение

• 1.    В результате проведенных исследований установлено, что подобранные условия культивирования консорциума пробиотических микроорганизмов обеспечивают высокую биохимическую активность и хорошие органолептические показатели инокулята.

• 2.    Введение в состав питательной среды селенита натрия позволяет повысить синтез эк-зополисахаридов, усилить симбиотические взаимоотношения между пробиотическими бактериями и производственно-ценные свойства консорциума.