Создание микрофлюидного биосенсора для диагностики и типирования Mycobacterium tuberculosis

Submitted 20.05.2021                         Revised 23.06.2021                        Published 30.06.2021

Список сокращений

ПВФК-биосенсор (PCSW-biosensor, Photonic Crystal Surface Waves Biosensor) — комплексный прибор для детекции процессов сорбции/десорбции биомолекул на специфической чувствительной поверхности

ОФК (1D PC, One-Dimensional Photonic Crystal) — одномерный фотонный кристалл: специальная синтетическая поверхность, представляющая собой многослойную диэлектрическую спектрально-селективную структуру

ltatatat

ГАТАТ

КТ ГА

ОБОСНОВАНИЕ

Согласно последним данным Всемирной организации здравоохранения, в Российской Федерации заболеваемость туберкулезом продолжает оставаться на высоком уровне, несмотря на наметившуюся тенденцию к стабилизации. В 2019 г. зарегистрировано более 60 тыс. новых случаев заболевания и 7536 летальных исходов [1, 2]. Особую и весьма значительную роль в обострении ситуации с туберкулезом играет появление и все большее распространение штаммов микобактерий, устойчивых к лекарственным препаратам. По некоторым данным, в мире около 4% случаев туберкулеза вызваны штаммами с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), а среди ранее леченных больных частота выявления МЛУ-штам-мов достигает 40%. В то же время на территории Российской Федерации показатели носят еще более негативный характер. Так, число МЛУ-штаммов среди впервые выявленных случаев достигает 30%, в то время как среди леченых больных превышает в иных регионах 60% [2, 3]. Таким образом, в недалеком будущем современная медицина, лишенная эффективных противотуберкулезных препаратов, может оказаться бессильна перед возрастающей угрозой повсеместного распространения устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis .

Очевидно, что в сложившейся ситуации весьма актуальны исследования, направленные на решение проблемы быстрой диагностики заболевания, своевременного выявления устойчивых к противотуберкулезным препаратам форм, а также адекватные противоэпидемические мероприятия, ориентированные на предупреждение распространения штаммов микобактерий (в том числе и устойчивых) в человеческой популяции. Большие перспективы и возможности в этом направлении открывают современные достижения молекулярной биологии и биофизики. В частности, принципиально новыми являются разработки в области микрофлюидных технологий и оптических безмаркерных биосенсоров. Использование микрофлюидного безмар-керного биосенсора на поверхностных оптических волнах в одномерном фотонном кристалле (ПВ-ФК-биосенсора) позволяет значительно упростить молекулярную идентификацию патогенов при лабораторной диагностике инфекций, в том числе туберкулеза. ПВФК-биосенсор позволяет анализировать широкий диапазон взаимодействий: от образования различных белок-белковых комплексов до взаимодействия олигонуклеотидов различной последовательности. Основным преимуществом технологии является прохождение реакций в изолированной зоне минимального объема, что исключает контаминацию, сокращает время анализа, делает удобным процедуру анализа для оператора. Регистрация таких взаимодействий проводится в реальном времени и не требует предварительного мечения целевых биомолекул [4]. В 2020 г. показан мультиплексный потенциал ПВФК-биосенсора с двумерным пространственным разрешением [5]. Таким образом, очевидна актуальность использования данной технологии при работе с возбудителем туберкулеза.

Цель исследования — разработка метода идентификации и типирования M. tuberculosis с помощью микрофлюидного ПВФК-биосенсора.

МЕТОДЫ

Зонды

Коллекцию полногеномных последовательностей для 5721 образца M. tuberculosis использовали для подбора зондов, обеспечивающих семейство-специфическое типирование возбудителя туберкулеза. Для сполиготипирования определены специфические спейсерные последовательности DR-региона (direct repeat) в геноме M. tuberculosis штамма H37Rv (NCBI Reference Sequence: NC_000962.3). Основываясь на опубликованных ранее данных [6], определены последовательности зондов, обеспечивающих первичное типирование M. tuberculosis по 43 спейсерам DR-региона. В представленной работе на 3'-ко-нец ДНК-зондов добавлены несколько нуклеотидов, позволяющих увеличить сайт гибридизации с одноцепочечной ДНК спейсера до 20 пар оснований. Терминальный 3'-концевой нуклеотид зонда модифицирован биотином для иммобилизации на стрептавидине. Нуклеотидная последовательность полученного ДНК-зонда для детекции 43-го спейсера: 5'-GGAGGTGCAGCA-acgtatac-3'-Biotin. Контроль вторичной структуры одноцепочечного ДНК-зонда и его потенциальной мишени проводился с помощью программы mFold [7].

Биосенсор

Регистрацию процесса взаимодействий биомолекул на поверхности проводили в реальном времени с помощью микрофлюидного безмаркерного ПВФК-биосенсора «EVA 2.0» (Россия) [4, 8]. Чувствительной поверхностью биосенсора является завершающий слой оксида кремния одномерно-

<линическая 2021 п эакти keu Том 12 №2

го фотонного кристалла (ОФК). Для модификации поверхности фотонного кристалла использовали водные растворы (3-аминопропил)триэтоксисила-на ([3-(Aminopropyl)triethoxysilane], APTES), декстранов Leuconostoc mesenteroides , бычьего сывороточного альбумина, полиаллиламина, глутарового альдегида, эпихлоргидрина и стрептавидина в натрий-фосфатном буфере (phosphate-buffered saline, PBS).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Разработан дизайн олигонуклеотидных зондов для детекции возбудителя туберкулеза, подобрана их оптимальная длина для гибридизации с ДНК-мишенью. Для повышения чувствительности детекции в экспериментах с олигонуклеотид-ными ДНК-мишенями изначально требовалось увеличить сорбционную емкость поверхности фотонного кристалла, что достигалось созданием на его поверхности разветвленной структуры полисахаридов. В настоящей работе использовали декстран с Mw 500 кДа, предварительно химически модифицированный для введения в полимерную цепь доступных функциональных групп для связывания с силанизированной поверхностью ОФК.

Кинетику взаимодействия модельного белка бычьего сывороточного альбумина с модифицированной поверхностью регистрировали на ПВФК-био-сенсоре; для сравнения приведены сорбционные кривые для модифицированной двумя способами поверхности ОФК: силанизация APTES и модификация полиаллиламином и глутаровым альдегидом [9] (рис. 1). По сравнению с поверхностью ОФК, модифицированной APTES, сорбционная емкость поверхности с полисахаридом возросла на 20%, что можно объяснить появлением трехмерной разветвленной структуры цепей декстрана.

Были подобраны оптимальные условия модификации поверхности ОФК декстраном, позволяющие достичь большей сорбционной емкости поверхности ОФК для последующей сорбции низкомолекулярных лигандов. На микрофлюидном безмаркер-ном биосенсоре на ПВФК получены сорбционные кривые детекции олигонуклеотидных ДНК-мишеней, моделирующих уникальные участки генома M. tuberculosi s. Чувствительность методики определяется соотношением сигнал–шум при регистрации процесса связывания олигонуклеотидов на поверхность ОФК биосенсора. Полученные нами результаты демонстрируют чувствительность на уровне 0,7 пг/мм².

Рис. 1. Изменение толщины сорбционного слоя (Δd) при связывании бычьего сывороточного альбумина с модифицированной поверхностью одномерного фотонного кристалла.

Fig. 1. The change in the adsorbed layer thickness (Δd) upon bovine serum albumin binding to the modified PC surface.

Примечание. МД — модифицированный декстран; ПАА — полиаллиламин; ГА — глутаровый альдегид; APTES — (3-аминопропил)триэтоксисилан.

Note. МД — modified dextran; ПАА — polyallylamine; ГА — glutaraldehyde; APTES — 3-(Aminopropyl)triethoxysilane.

ГАТАТ

Рис. 2. Регистрация последовательной сорбции стрептавидина и биотинированного ДНК-зонда 5'-GGAGGTGCAGCA-acgtatac-3'-Biotin на модифицированную поверхность фотонного кристалла.

Fig. 2. Registration of the sequential adsorption of streptavidin and a biotinylated DNA probe, 5'-GGAGGTGCAGCA-acgtatac-3'-Biotin, on the modified PC surface.

Примечание. PBS (phosphate-buffered saline) — натрий-фосфатный буфер; БСА — бычий сывороточный альбумин.

Note. PBS — phosphate-buffered saline; БСА — bovine serum albumin.

Для ковалентного связывания биотинилированных олигонуклеотидных ДНК-зондов в реальном времени на поверхности ОФК и последующей регистрации специфического взаимодействия зондов на активированную поверхность ОФК предварительно иммобилизовали стрептавидин. Неспецифические сайты связывания на поверхности ОФК блокировали 0,1 мг/мл раствора бычьего сывороточного альбумина (рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

На сегодняшний день проблема быстрой и ранней диагностики туберкулеза актуальна во всем мире. Активно ведутся работы по выявлению белков микобактерий в крови человека [10]. Однако системный подход к изучению особенностей физиологии микобактерий показал ограниченность таких методов [11]. Нуклеотидные последовательности зондов, отобранные в данном исследовании, соответствуют спейсерам, расположенным между прямыми повторами (DR-регионами) генома M. tuberculosis, и обеспечивают достоверное типи-рование патогена по принадлежности к семейству [6]. Ранее было показано, что метод мультиплекс- ного биосенсинга на поверхностных волнах ОФК с двумерным пространственным разрешением в реальном времени может быть использован для регистрации процессов связывания антиген–антитело с достаточной чувствительностью [12], в связи с чем в данной работе метод был адаптирован для типирования возбудителя туберкулеза. Предложенный в данной работе способ модификации фотонного кристалла обеспечивает большую адсорбционную емкость поверхности, чем известные из литературных данных [9], и позволяет решить проблему чувствительности, связанную с малым количеством бактерий в биологическом материале. Кроме того, потенциальным решением данной проблемы может стать проведение определенного оптимального количества циклов полимеразной цепной реакции перед детекцией на ПВФК-биосенсоре.

Таким образом, на основании проведенного исследования можно сделать вывод о большом потенциале диагностической системы, основанной на ПВФК-биосенсоре, для экспрессной диагностики и типирования возбудителя туберкулеза.

клиническая: 9П91 Том 122 №12

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе работы выполнен анализ модификации поверхности фотонного кристалла на основе взаимодействия активированной поверхности с функционализированным декстраном L. mesenteroides . Разработан метод дизайна зондов и предложена модельная система из олигонуклеотидов для детекции одноцепочечной ДНК возбудителя туберкулеза с помощью микро-флюидного ПВФК-биосенсора. Данный метод модификации и активации рабочей поверхности фотонного кристалла позволяет связывать олигонуклеотиды различной последовательности для дальнейшего применения ПВФК-биосенсора в диагностике.

Предложенный подход позволит в дальнейшем расширить панель диагностических зондов, в том числе для выявления маркеров резистентности. В свою очередь, использование такого биосенсора в диагностике туберкулезной инфекции позволит обеспечить максимально быструю постановку диагноза, определение лекарственной устойчивости штаммов и, соответственно, назначение схемы лечения в максимально короткие сроки.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Басманов Д.В., Беспя-тых Ю.А. — концепция исследования, написание текста рукописи; Митько Т.В., Шакуров Р.И., Ширшиков Ф.В., Сизова С.В., Алиева Е.В., Коноп-ский В.Н. — получение данных для анализа, анализ полученных данных, написание текста рукописи, обзор публикаций по теме статьи. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).