Создание полиспецифического ботулинического коньюгата для иммуноферментного анализа

Ботулизм – остро протекающая кормовая токсикоинфекция, вызываемая токсином анаэробного спорообразующего микроба Cl. botulinum. Эпидемиология ботулизма исключительно специфична и не укладывается в классические представления об эпидемиологии инфекционных болезней. По данным Л. В. Громашевского [1] источником заболевания может служить только больной человек или больное животное. С другой стороны широкое распространение возбудителя ботулизма в природе послужило причиной мнения, что возбудитель убиквитарен и может размножаться и образовывать токсин в почве.

В настоящее время известно 7 типов возбудителя ботулизма (A, B, C, D, E, F, G) соответственно вырабатывающих 7 токсинов, в свою очередь палочка типа С вырабатывает два различных токсина (Л. Месборяну, 1963; Т. И. Булатова и др., 1965), что позволяет говорить о существовании не 7, а 8 ботулинических токсинов. Все они отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками. Каждый серовар характеризуется специфической иммуногенностью. Имеется О-антиген, который является общим для всех сероваров.

По морфологии возбудители ботулизма – небольшие палочки длиной 4-9 мкм и шириной 0,6-0,9 мкм с закругленными концами. Палочки образуют субтерминальные или терминальные споры и имеют вид теннисной ракетки. Эти микробы легко окрашиваются различными анилиновыми красками. Молодые клетки окрашиваются по Граму положительно. Через 4-5 суток роста палочки окрашиваются грамотрицательно. Микробы подвижны, имеют от 4 до 35 жгутиков, капсулы не образуют. Токсин ботулизма представляет собой протеин, состоящий как бы из двух фрагментов, связанных дисульфидными мостиками, что обеспечивает необычную устойчивость токсина во внешней среде и длительное сохранение активности. Токсин ботулизма прочно связан с белком микроба и попадает в организм животного только при аутолизе клетки. Токсин выделяется в среду хозяина по мере синтезирования, не задерживаясь в клетке при активном росте микроба [6].

Основой лабораторной диагностики ботулинического токсина или возбудителя ботулизма является биопроба на белых мышах. В качестве экспресс методов лабораторной диагностики используют определение фагоцитарного показателя и постановку РНГА с сенсибилизированными антитоксическими сыворотками. Однако, при вскрытии животных, павших от «колбасного яда», точно поставить диагноз не всегда удается, ведь концентрация токсина в крови ничтожна. Поэтому вопрос по быстрой и точной диагностике ботулизма, в некоторых случаях, стоит весьма остро. Например, в условиях чрезвычайной ситуации, военного положения, при угрозе применения биологического оружия, а также в случаях отравления продуктами питания людей, на сегодняшний день нет средств и методов индикации возбудителя ботулизма и обнаружения ботулинического токсина ускоренным методом.

Целью работы настоящих исследований является, разработка современных тест-систем для выявления патогенного анаэроба Clostridium botulinum и индикации его токсина в продуктах животноводства, а также в объектах внешней среды. Все вышесказанное и обуславливает безусловную актуальность настоящей работы и необходимость создания экспресс анализа.

Материалы и методы. Проведена работа по получению поливалентной гипериммунной антиботулинической сыворотки на кроликах, по следующей схеме. Для получения гипериммунной сыворотки использовали антигены (из 4х культур) приготовленные тремя методами: 1) живая культуральная жидкость с содержанием возбудителя и нейротоксического комплекса; 2) гамма – облученный; 3) инактивированный формалином. Из культур готовили образцы, которые состояли из смеси четырех (А, В, С, D) типов антигенов, а так же их анатоксинов в соотношении 4:1, для гипериммунизации кроликов. В опыт брали 3 группы кроликов – иммунизацию проводили тремя видами антигенов, различными дозами и интервалом между введениями. Интервал между введениями 4 дня, за день до следующего введения у кроликов брали кровь, для определения титра ботулиновых антител в РНГА, РА.

Предварительно, после последнего введения взвеси, пробы крови исследовали на 3й день, а тотальное обескровливание (из сердца) провели на 7 день после последнего введения антигена. Полученная нами поливалентная сыворотка, состоящая из смеси нативных корпускулярных антигенов А,В,С,D и их анатоксинов, наработанная по схеме №1 (гипериммунизация кроликов внутривенно, внутривенно, внутривенно) с конечным титром АТ в сыворотки крови 1:64 в РНГА [2]. Исходя из литературных данных видно, что титры антител после иммунизации как моно- так и поливалентными антигенами одинаковы. Следовательно, при иммунизации поливалентными антигенами явление явление «конкуренции антигенов» отсутствовало [5].

Результаты исследований. Из полученной сыворотки получили глобулины, путем осаждения сульфатом аммония по общепринятой методике, из которого был получен полиспецифический иммуноферментный пероксидазный ботулинический коньюгат, для обнаружения возбудителя и его токсина в объектах внешней среды и продуктах питания.

Для конъюгирования иммуноглобулинов с ферментом использовали ковалентный способ. Принцип сшивки основан на окислении углеводной части фермента с образованием альдегидных групп, которые впоследствии взаимодействуют с аминогруппами иммуноглобулина.

Иммунопероксидазные конъюгаты готовили по методике X. Wilson и P.K. Nacane (1978). Для этого 5 мг пероксидазы хрена растворяли в 1 мл дистиллированной воды и вносили 0,2 мл свежеприготовленного 0,1 М NaJO 4 . Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 20 минут, после чего диализировали в течение 18-20 часов против 100 мл 0,01 М ацетатного буфера рН 4,4 при температуре (4±2)⁰С. После чего доводили рН пероксидазного альдегида с помощью 0,2 М раствора карбоната натрия до рН 9-9,5 и сразу же вносили 1 мл иммуноглобулина, содержание белка в котором должно быть 8-10 мг/мл. При содержании белка более 10 мг/мл его концентрацию доводили до требуемого показателя добавлением 0,01 М КББ рН 9,5. Смесь фермента с иммуноглобулином перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре и проводили диализ против 0,85% раствора хлористого натрия рН 7,3-7,6 в объеме З л, в течение 18-20 часов при температуре (4±2)⁰С. По окончании диализа иммунопероксидазный конъюгат проверяли на стерильность, активность и специфичность.

Проведенные исследования в ИФА с использованием полиспецифического иммуноферментного пероксидазного ботулинического коньюгата показали положительную реакцию со всеми типами ботулизма (А,В,С,D,E,F,G ) в тех случаях когда образцами исследований служили антигенны приготовленные из возбудителя, при этом титры в среднем составляли 1:128 – 1:256. Титры к антигеннам приготовленными из токсинов А,В,С,D так же составляли в среднем 1:64 – 1:256, титры токсинов типов E,F,G составляли 1:4 – 1:8, при отрицательных результатах в контроле. Что говорит о высокой специфичности и активности иммуноферментного пероксидазного ботулинического коньюгата к возбудителям и продуцируемым ими токсинам типов А,В,С,D.

Заключение. На сегодняшний день нет ускоренных методов индикации возбудителя ботулизма в объектах внешней среды и в патологическом материале. В настоящее время исследования продуктов питания животного происхождения на безопасность проводятся многоступенчатыми способами – посевы на питательные среды (среда Китт-Тароцци, многослойный агар и т.п.) и т.д. Окончательный результат получают биологической пробой на мышах.

По данным видно, что наиболее перспективным при получении поливалентных сывороток является использование культуральной жидкости с содержанием живого возбудителя и нейротоксического комплекса, по сравнению с инактивированными формами возбудителя.

Разработана методика получения полиспецифического иммуноферментного пероксидазного ботулинического коньюгата для экспресс-индикации возбудителя ботулизма и ботулинового токсина в объектах внешней среды и патологическом материале.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Громашевский, Л.B. Частная эпидемиология. Ботулизм / Л.B. Громашевский, Г.М. Вайндрих // Медгиз, 1974. С. 214. 2. Иванов А. В., Мустафин Т.Р., Мустафина Э. Н. Ветеринарный врач № 3, 2013 С.8-10. 3. Иванова М. А. Ботулизм : учеб.-метод. пособие / М. А. Иванова. – Минск : БГМУ, 2009. – 24 с. ISBN 978-985-462-801-1. 4. Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология. - Омск: Изд. ОмГАУ, 1996. – С. 314 – 319. 5. Матвеев К.И. Ботулизм. – М.: Медицина, 1959. – С. 5-41, 350-361. 6. Никифоров В.Н., Никифоров В.В. Кн.: Ботулизм. - Л.: Медицина, 1985. – С 104-116.

СОЗДАНИЕ ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОГО БОТУЛИНИЧЕСКОГО КОНЬЮГАТА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Мустафин Т.Р., Мустафина Э. Н., Чернов А.Н., Садыков Н.С.

Резюме

Разработан полиспецифический иммуноферментный пероксидазный коньюгат, на основе высокоактивной полиспецифической антиботулинической сыворотки, для экстренной индикации возбудителя Cl. botulinum и их токсинов в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале методом иммуноферментного анализа.

CREATING POLYSPECIFIC BOTULINUM CONJUGATE FOR IMMUNE-ENZYME ANALYSIS

Mustafin T.R., Mustafina E.N., Chernov А.H., Sadykov N.S.