Создание тест-систем для идентификации фитопатогенов методом твердофазного иммуноферментного анализа

Автор: Павловская Н.Е., Солохина И.Ю., Лушников А.В.

Журнал: Биология в сельском хозяйстве @biology-in-agriculture

Рубрика: Актуальные вопросы отраслей растениеводства

Статья в выпуске: 4 т.8, 2015 года.

Бесплатный доступ

В настоящее время существует необходимость применения высокочувствительных и специфичных методов анализа растительного материала, зараженного фитопатогенами для выявления довизуальных признаков проявления болезней растений. Методы, основанные на иммуноферментном анализе, одним из которых является ELISA-тест (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). Данный метод позволяет увеличить чувствительность анализа и сократить время тестирования до нескольких часов, является наиболее распространенным и широко используемым методом анализа растительного материала для диагностики и идентификации фитопатогенов. В последенее время наблюдается повсеместное заражение овощных культур корневыми гнилями не только в открытых грунтах, но и в теплицах. Одним из распространенных повреждений растений является фузариозное увядание, вызываемое грибами рода Fusarium spp. Была разработана тест-система с использованием метода иммуноферментного анализа на наличие фитопатогена Fusarium oxysporum в овощных и зеленых культурах, обработанных различными препаратами. Выявлены образцы огурца сорта «Кураж», пораженные фузариозом.

Еще

Твердофазный иммуноферментный анализ, фитопатогены, корневая гниль, овощные культуры

Короткий адрес: https://sciup.org/147229288

IDR: 147229288

Текст научной статьи Создание тест-систем для идентификации фитопатогенов методом твердофазного иммуноферментного анализа

Диагностика фитопатогенов методом ИФА хорошо зарекомендовала себя в широкомасштабных рутинных тестированиях растительного материала. В настоящее время специфичность иммуноферментного анализа в значительной степени увеличена за счет использования моноклональных и рекомбинантных антител [3; 5].

Для определения антигенов и антител применяются твердофазный вариант иммуноферментного анализа. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности [6].

Овощные культуры, как известно, поражаются многочисленными вирусными, бактериальными и грибными заболеваниями. Некоторые болезни являются серьезной угрозой при выращивании овощей.

При возделывании таких овощных и зеленых культур потери от фитопатогенов были и остаются основным фактором, оказывающим негативное влияние на урожайность и продуктивность. Причинами увеличения количества штаммов фитопатогенов, поражающих культуры: влияние климатических условий, высокая влажность, возделывание сортов со слабой устойчивостью к патогенам, появление новых штаммов.

За последние десятилетия наблюдается повсеместное заражение овощных культур корневыми гнилями не только в открытых грунтах, но и в теплицах. Одним из распространенных повреждений растений является фузариозное увядание, вызываемое грибами рода Fusarium spp. [6].

Корневая гниль томата распространена как в закрытом, так и в открытом грунте и проявляется в течение всей вегетации. Заболевание является комплексным и возникает в результате неблагоприятных условий выращивания, которые ослабляют растения и этим самым способствуют развитию паразитных почвенных патогенов. Основными возбудителями заболевания являются грибы рода Fusarium. На пораженных фузариозом сеянцах заболевание проявляется в побурении корневой шейки и корня, стебель утончается, семядольные и молодые листочки увядают, растение погибает. У более взрослых растений желтеют и увядают листья, на нижней части стебля и и корне буреет кора, стебли размочаливаются, растение увядает и засыхает. На срезе корня хорошо видны побуревшие сосуды, в которых развивается мицелий гриба. Мицелий белый паутинистый, с розовым или желтоватым оттенком. Конидиеносцы хорошо выраженные, простые или разветвленные. Макроконидии образуются на простых или разветвленных конидиенос-цах, обычно серповидные с различным характером и степенью изогнутости, с 3-5 перегородками. Микроконидии обильно образуются на длинных цилиндрических конидиеносцах, имеют овальноцилиндрическую форму и размеры 10,8 - 18,6 х 1,5 - 3 мкм. Хламидоспоры одно-двухклеточные, неокрашенные. Зараженные сеянцы отстают в росте (при сильном заражении часто погибают), семядоли желтеют и увядают [1] . На более крупных взрослых рас тениях первые симптомы болезни проявляются как пожелтение более старых нижних листьев и привяда-ния верхушек побегов, затем увядают целые побеги и гриб распространяется по растению вверх. Жилки листьев становятся более светлыми, черешки листьев деформируются. Листовая пластинка закручивается, а позже опадает, но может просто увядать и отмирать, без опадения с растения. Целые ветви приобретают желтую окраску, что в полевых условиях напоминает "желтые флаги". Часто наблюдается пожелтение листочков с одной стороны сложного листа или листьев с одной стороны ветки [2] .

Корневые гнили, вызываемые почвообитающими патогенами, являются наиболее вредоносными и распространенными заболеваниями огурца в защищенном грунте. Они распространены повсеместно в зоне выращивания культуры. Признаки проявляются во всех фазах развития растения. Зараженные проростки погибают, не достигая поверхности почвы, у молодой рассады наблюдаются задержка роста, пожелтение, опадение семядолей и полегание. Наиболее характерные симптомы наблюдаются в период цветения и начала плодоношения. Вначале верхняя часть растения увядает днем, а в ночные часы восстанавливается. Позднее растения увядают полностью и не могут восстановить свой тургор ни ночью, ни после полива. Наблюдается и острая форма развития болезни, при которой растение внезапно увядает и быстро засыхает. На разрезе основных междоузлий стебля наблюдается темное окрашивание тканей. На корневой шейке могут формироваться язвы, из-за которых она продольно растрескивается. Плоды пораженных растений очень горькие [2].

Фузариозное увядание перца начинается через несколько дней после его инфицирования. Течение болезни и ее проявления зависят от устойчивости растения и болезнетворности гриба, а также от условий среды. В растение инфекция проникает через корни, вызывая в дальнейшем их отмирание. Грибница развивается внутри сосудов стеблей. При осмотре диагонального среза стебля или корней, в проводящих тканях видны красновато-коричневые полосы. Вследствие этого растение увядает и погибает. Симптомы фузариозного увядания вначале проявляются в виде увядания и незначительного пожелтения верхних листьев. По мере развития болезни, увядающие листья приобретают окраску от бледно-зеленой до желто-коричневой. На поверхности зараженных плодов вокруг плодоножки появляются вдавленные сохнущие участки более темной окраски. Часто во влажных условиях на поверхности некрозов развивается спороношение розоватого цвета [2].

Фузариоз лука, или гниль донца лука проявляется в виде следующих симптомов: в период созревания лука наблюдается его быстрое отмирание, большинство корней сгнивает, в области донца луковицы развивается обильная белая грибница, луковицы размягчаются. В период созревания луковиц заболевание проявляется в виде быстрого отмирания листьев, которое начинается с усыхания верхушки. В период хранения поражённые луковицы становятся мягкими, водянистыми, в области донца появляется сильно разросшаяся грибница. Иногда между чешуями появляется розовый мицелий гриба в виде подушечек [2].

Таким образом, актуальным является выявление довизуальных признаков развития болезней растения на ранних стадиях развития. Данную проблему успешно решает метод иммуноферментного анализа растений. Поэтому целью наших исследований была разработка тест-системы с помощью метода иммуноферментного анализа на наличие фитопатогена Fusarium oxysporum в овощных и зеленых культурах.

Материалы и методы исследований

Измельчали навеску растительного материала (листья и плоды) с фосфатно-солевым буферным раствором, pH 7,4 и стеклянным песком в ступке, центрифугировали при 1000 об./мин. Отбирали из супернатанта аликвоту в микропробирки и замораживали (-20°С).

Для проведения анализа использовали стерильные планшеты Терассаки на 96 лунок, с адгезивным покрытием и U-образным дном. Готовили антитела 200 мг/л, нагружали по 100 мкл каждую лунку планшета, инкубировали 2 часа при 4°С, в атмосфере с 5% СО2. Троекратно отмывали 300 мкл раствора NaCl (0,15М), и 7 раз дистиллированной водой.

Вносили по 100 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (10 г/л) в 0,01М фосфатном буферном растворе, содержащем NaCl (0,15М) и ТВИН 20 (0,05% w/v), pH 7,3±0,1, инкубировали 1 час при комнатной температуре. Промывали по той же схеме.

Подготовленные аликвоты доводили до комнатной температуры. В лунки планшета вносили 25 мкл контрольных и опытных образцов, инкубировали 1 час при 37°С на термостатируемом шейкере, с частотой встряхивания 650 оборотов в минуту, троекратно отмывали 300 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ-Т, «Вектор Бест»),

Вносили 100 мкл раствора конъюгата, меченного пероксидазой хрена, инкубировали 30 минут при 37°С на термостатируемом шейкере, с частотой встряхивания 650 оборотов в минуту. Несвязавшийся конъюгат декантировали, лунки планшета отмывали фосфатносолевым буфером, троекратно по 300 мкл.

Вносили 100 мкл хромогена в субстратнобуферном растворе (ТМБ+СБР, «Вектор Бест»), инкубировали 15 минут при комнатной температуре в темном месте. Добавляли 100 мкл НС1 1N (Стопреагент, «Вектор Бест») для остановки реакции. Измеряли оптическую плотность при длине волны 450620 нм против холостой пробы на планшетном фотометре Multiscan EX.

Расчет критической и оптической плотности (Cut off) проводили по уравнению Cut off = А-К~ + В-К” + С-КК + D. Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1- Результаты критической и оптической плотности исследуемых образцов методом ИФА

№	Позиция на планшете	Образцы	D450-620	Результат
-	А\|.2.3	Blank (холостая)	X	X
-	В 1.2.3	К_ (контроль полож.)	1,537	X
—	С 1.2.3	К.(коптроль отриц.)	0,130	X
—	D 1.2.3	КК (контроль качества)	1,425	X
Cut off			1,314	X
Огурцы сорт «Кураж» (1 сбор)
1	Е 1.2.3	Настоящий лист (предлагаемое средство)	0,975	-
2	F 1.2.3	Настоящий лист (контроль)	0,793	-
3	G12.3.	Настоящий лист («Фитоспорип М»)	1,320	+
4	Н1.2.3	Настоящий лист (Trihoderma viridae)	1,498	+
5	А4.5.6	Начало цветения	0,691	-
Огурцы сорт «Кураж» (2 сбор)-листья
6	В4.5.6	Контроль зараженный	1,375	+
7	С4.5.6	Контроль незараженный	0,624	-
8	D4.5.6	«Фитоспорин М» (рекомендованный фон)	0,542	-
9	Е4.5.6	Препарат «Trichoderma viridae» 100% фон	1,584	+
10	F4.5.6	Комплексное средство (рекомепд.фоп)	0,697	—
И	G4.5.6	Контроль зараженный па 50% пестициде	1,584	+
12	Н4.5.6	Контроль незараженный па 50% пестициде	0,752	-
13	А7.8.9	«Фитоспорип М» (50% фон)	1,476	+
14	В7.8.9	Препарат «Trichoderma viridae (50% фон)	1,741	+
15	С7.8.9	Комплексное средство па 50% фоне	0,890	—
Огурцы сорт «Кураж» (3 сбор)-листья
16	D7.8.9	Контроль на 100% фоне	0,751	-
17	Е7.8.9	«Фитоспорип М» па 100% фоне	0,272	-
18	F7.8.9	препарат «Trichoderma viridae (на100% фоне)	1,368	+
19	G7.8.9	Комплексное средство па 100% фоне	0,774	-

20	Н7.8.9	Контроль на 50% фоне	0,501	-
21	А\|0,11,12	«Фитоспорип М» па 50% фоне	1.546	+
22	Bio.ll.12	Препарат «Trichoderma viridae ( па 50% фоне)	1,925	+
23	C10.ll.12	Предлагаемое средство па 50% фоне	0,600	-
Огурцы сорт «Кураж» - плоды
24	Dio.ll.12	Контроль па 100% фоне	0,356	-
25	E10.ll.12	«Фитоспорип» па 100% фоне	0,735	-
26	Fio.ll.12	препарат «Trichoderma viridae( на100% фоне)	1.483	+
27	Gio.ll.12	Комплексное средство па 100% фоне	0.835	-
28	H10.ll.12	Контроль на 50% фоне	1,375	+
29	А1.2.3	«Фитоспорип М» па 50% фоне	1,374	+
30	в 1.2.3	препарат «Trichoderma viridae»(Ha 50% фоне)	1.963	+
31	С 1.2.3	Предлагаемое средство па 50% фоне	0,956	-
Перец «Калифорнийское чудо» - листья
32	D 1.2.3	Всходы без опрыскивания	1.069	■
33	Е\|. 2.3	Всходы с опрыскиванием	0,535	-
34	F\|. 2.3	До цветения без опрыскивания	1.298	-
35	012.3.	До цветения с опрыскиванием	0,216	-
36	Н\| ₂.3	Цветение без опрыскивания	0,539	-
37	А4.5.6	Цветение с опрыскиванием	0,422	-
Перец «Клаудио»-листья, плоды
38	В4.5.6	Всходы без опрыскивания	1.069	-
39	С4.5.6	Всходы с опрыскиванием	0,978	-
40	D4.5.6	До цветения без опрыскивания	0,349	-
41	Е4.5.6	До цветения с опрыскиванием	0.892	-
42	F4.5.6	Цветение без опрыскивания	0,514	-
43	G4.5.6	Цветение с опрыскиванием	0,970	-
44	Н4.5.6	Всходы (пестициды)	0,250	-
45	А7.8.9	Всходы («Эпин»)	0,429	-
46	В7.8.9	До цветения (пестицид)	0,610
47	С7.8.9	До цветения («Эпип»)	1.006
48	D7.8.9	Цветение (пестицид)	1.006
49	Е7.8.9	Цветение («Эпип»)	0,632	-
50	F7.8.9	Плоды (пестицид)	0.901	-
51	G7.8.9	Плоды («Эпип»)	0.862	-
Томаты - листья и плоды
52	Н7.8.9	Плоды (пестициды)	0,591	-
53	Аю.и.12	Плоды (пестицид + комплексное средство)	0,402	-
54	Bio.ll.12	Плоды (комплексное средство)	0,429	-
55	C10.ll.12	Плоды контроль	0,414
56	D1 о. 1 1.12	Листья без обработки	0,734
57	E10.ll.12	Листья, обработанные пестицидом	0.648	-
58	F10.ll.12	Листья, обработанные комплексным средством	0.820	-
Лук «Золотистый» и «Стригуновский» 14-е сутки
59	G10.ll.12	Аммиачная селитра + «Эпин» (контроль)	0,930	-
60	H10.ll.12	Аммиачная селитра + комплексное средство (10"⁹ М)	0,495	-
61	А1.2.3	А нормы аммиачной селитры + комплексное средство (10"⁹ М)	0,774	-
62	В 1.2.3	Предлагаемое средство (10"⁹ М)	0,501	-
63	С 1.2.3	Аммиачная селитра + «Эпип» (контроль)	0,751	-
64	D 1.2.3	Аммиачная селитра + комплексное средство (10"⁹ М)	0,272	-
65	Е 1.2.3	А нормы аммиачной селитры + комплексное средство (10"⁹ М)	0,356	-
66	F\|. 2.3	Комплексное средство (10"⁹ М)	0,735	■
Лук «Золотистый» и «Стригуновский» 25-е сутки
67	G1.2.3.	Аммиачная селитра + «Эпип» (контроль)	0,954	■
68	Hl.2.3	Аммиачная селитра + комплексное средство (10"⁹ М)	0,422	-
69	А4.5.6	А нормы аммиачной селитры + комплексное средство (10"⁹ М)	0,833	-
70	В4.5.6	Комплексное средство (10"⁹ М)	0,508	-
71	С4.5.6	Аммиачная селитра + «Эпип» (контроль)	0,860	-
72	D4.5.6	Аммиачная селитра + комплексное средство (10"⁹ М)	0.261
73	Е4.5.6	А нормы аммиачной селитры + комплексное средство (10"⁹ М)	0,393	-
74	F4.5.6	Комплексное средство (10"⁹ М)	0,672	-

Примечание'. « + » положительный результат; « - » отрицательный результат; х-отсутствие результата

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о наличии, либо отсутствии грибной инфекции в овощных и зеленых культурах. Разработанный метод им-муноферменного анализа является качественным

В ходе проведенных исследований установлены образцы овощных культур, давших положительную реакцию на возбудитель фузариоза: огурец сорта «Кураж»: первый сбор (листья) - при обработке препаратом «Фитоспорин М» на 50% фоне и препаратом «Trichoderma viridae» на 50% и 100% фоне; второй сбор (листья) - контроль зараженный, образцы, обработанный препаратом «Trichoderma viridae»Ha 50% и 100% фоне, контроль зараженный на 50% пестициде, при обработке препаратом «Фитоспорин М» на 50% фоне; третий сбор (листья) - образцы, обработанные препаратом «Trichoderma viridae» на 50% и 100% фоне, препаратом «Фитоспорин М» на 50% фоне; плоды - выявлены образцы, обработанные препаратом «Trichoderma viridae» на 50% и 100% фоне, препаратом «Фитоспорин М»на 50% фоне, контроль на 50% фоне.

При обработке образцов комплексным средством, пестицидами, препаратом «Эпин» выявлены образцы овощных культур: перец сорта «Клаудио» и «Калифорнийское чудо», томаты, давшие стабильный отрицательный результат на возбудитель фузариоза.

Таким образом, создание тест-системы на основе иммуноферментного анализа может применяться в качестве метода определения фитопатогена Fusarium oxysporum, вызывающего корневые гнили овощных культур в условиях закрытого грунта.

Список литературы Создание тест-систем для идентификации фитопатогенов методом твердофазного иммуноферментного анализа

Ахатов А.К. Мир томата глазами фитопатолога. - М.: КМК. - 2012; 296 с.
Станчева И. Атлас болезней сельскохозяйственных культур. Том 1. Болезни овощных культур. - Пенсофт. - София-Москва. - 2005. - 2-е изд.
Нетесова И.Г., Бобкова М.Р. Внутрилабораторный контроль качества неколичественных методов ИФА: информационно-методическое пособие / И.Г. Нетесова, М.Р. Бобкова. - Новосибирск: Вектор-Бест, 2011;20 с.
Crowther J.H. Monoclonal antibodies. Methods in Mol. Biol. The ELISA Guidebook 516, 225-289. - 2009.
Clark, MF and AN Adams (1977). Characteristics of the microplate method of enzyme linked immuno-sorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol 34:475-483.
Martin R.R., James D., Levesque C.A. 2000. Impact of molecular diagnostic technologies on plant disease management.Annu.Rev.Phytopathol., 38;207-239.

Статья научная