Спектрофотометрическая методика определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях какалии копьевидной (Cacalia hastata L.)
Журнал: Вестник Восточно-Сибирского государственного университета технологий и управления @vestnik-esstu
Статья в выпуске: 2 (33), 2011 года.
Бесплатный доступ
Разработана спектрофотометрическая методика определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях Cacalia hastata, которая использует прямой вариант анализа в УФ-области. В качестве стандартного образца вещества сравнения выбрана хлорогеновая кислота - доминирующий компонент комплекса фенилпропаноидов данного вида растительного сырья. Установлено, что суммарное содержание фенилпропаноидов в листьях Cacalia hastata составляет 3.34-13.64%. Проведенный валидационный анализ показал, что методика соответствует критериям приемлемости.
Похожие статьи в разделе Физиология растений
Короткий адрес: https://sciup.org/142142308
IDS: 142142308 | УДК: 581.19:543.42
Spectrophotometric method of total phenylpropanoid content in Cacalia hastata L. Leaves
A spectrophotometry method for determining the phenylpropanoids total content in the leaves of Cacalia hastata was developed. This method uses a straight version of the analysis in the UV region of spectra. Chlorogenic acid is used as a standard sample of a reference substance, which is the dominant component of Cacalia hastata phenylpropanoids complex. It was found that the total content of phenylpropanoids in the leaves of Cacalia hastata is 3.34-13.64%. Carried out validation analysis showed that the technique meets the eligibility criteria.
Текст научной статьи Спектрофотометрическая методика определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях какалии копьевидной (Cacalia hastata L.)
Листья какалии копьевидной ( Cacalia hastata L.) рассматриваются в качестве перспективного лекарственного сырья, обладающего широким спектром биологической активности [1]. Ранее для анализа листьев C. hastata были предложены методики количественного определения суммарного содержания органических кислот, каротиноидов и аскорбиновой кислоты [2]. Стандартизация с использованием данных методик является приемлемой, но, учитывая современные потребности фармацевтической практики, нами пересмотрены подходы к анализу данного вида растительного сырья.
Целью настоящей работы является разработка спектрофотометрической методики определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях C. hastata .
Экспериментальная часть
Растительное сырье – листья C. hastata , были собраны в разных районах Республики Бурятия. Видовая принадлежность определена д.фарм.н. Т.А. Асеевой (ИОЭБ СО РАН). Образцы сырья хранятся в гербарии Отдела биологически активных соединений ИОЭБ СО РАН.
В работе использовали достоверные образцы хлорогеновой и кофейной кислот (Sigma); остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а. Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре UV-Vis-mini (Shimadzu, Япония) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
Методика количественного определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях C. hastata. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 0.5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шли- фом вместимостью 250 мл, приливают 100 мл 70% этанола, присоединяют обратный холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 200 мл. Экстракцию сырья повторяют в тех же условиях еще раз. Объем объединенного фильтрата доводят до метки 70% спиртом этиловым (раствор А).
-
1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70% спиртом этиловым (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б определяют при длине волны 330 нм.
Суммарное содержание фенилпропаноидов ( Х) в пересчете на хлорогеновую кислоту (в %) и абсолютно-сухое сырье вычисляют по формуле:
D • KV 100 m • 530 ‘ 100 - W ’ где D - оптическая плотность исследуемого раствора; KV- коэффициент разбавления исследуемого раствора (2500); 530 - удельный коэффициент погашения хлорогеновой кислоты в 70% спирте этиловом при длине волны 330 нм; m - масса сырья, г; W- потеря в массе при высушивании сырья, %.
Определение параметров специфичности, повторяемости, правильности, межоперационной точности и точности разработанной методики проводили согласно [3-5].
Обсуждение результатов
При исследовании УФ-спектра спиртового извлечения C. hastata установлено присутствие максимума поглощения при 330±2 нм (рис. 1). Спектр поглощения доминирующих фенилпропаноидов - хлорогеновой и кофейной кислот, совпадает с таковым спиртового извлечения из сырья, поэтому оба соединения могут быть использованы в качестве стандартных веществ для количественного определения суммарного содержания фенилпропаноидов, имеющих максимум поглощения в области 330 нм. Нами в качестве стандартного соединения была выбрана хлорогеновая кислота; для расчета использовали величину удельного коэффициента погашения (Е 1% 1см), равную 530.
В экспериментах по определению оптимальных параметров процесса экстракции флавоноидов, обеспечивающих их максимальное извлечение, исследовалось влияние типа экстрагента, температуры экстракции, степени измельчения сырья, соотношения сырье - экстрагент, кратности и времени экстракции.
Рис. 1. УФ-спектры поглощения спиртового извлечения листьев C. hastata (1), хлорогеновой (2) и кофейной кислот (3)
Эффективность экстракции оценивалась по содержанию в извлечениях фенилпропаноидов (табл. 1). Определено, что оптимальными параметрами экстракции флавоноидов являются: степень измельчения сырья 1.0 мм, температура экстракции 100° С, двукратная экстракция длительностью 60 мин каждая при соотношении сырье - экстрагент 1:200.
В ходе проведения валидации разработанной методики были исследованы параметры специфичности, повторяемости, правильности, межоперационной точности и точности (табл. 2).
Установлено, что методика определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях C. hastata спектрофотометрическим методом соответствует критериям приемлемости. Заданные критерии удовлетворяют требованиям соответствующей нормативной документации.
Влияние технологических параметров на степень экстракции фенилпропаноидов (ФПр) из листьев C. hastata а
|
Исследуемый параметр |
Суммарное содержание ФПр, % б |
Исследуемый параметр |
Суммарное содержание ФПр, % б |
|
|
Экстрагент (концентрация этанола, %) |
Степень измельчения, мм |
|||
|
20 |
5.07±0.10 |
5 |
2.21±0.04 |
|
|
40 |
5.03±0.10 |
3 |
4.15±0.08 |
|
|
60 |
5.24±0.11 |
2 |
6.33±0.12 |
|
|
70 |
7.14±0.14 |
1 |
7.11±0.14 |
|
|
80 |
7.04±0.14 |
0.5 |
7.04±0.14 |
|
|
95 |
6.67±0.12 |
0.25 |
7.01±0.13 |
|
|
Температура, ºС |
Соотношение сырье : экстрагент |
|||
|
20 |
2.07±0.04 |
1:30 |
1.10±0.02 |
|
|
40 |
3.73±0.07 |
1:50 |
2.73±0.05 |
|
|
60 |
4.81±0.10 |
1:70 |
5.11±0.10 |
|
|
80 |
6.15±0.12 |
1:100 |
6.88±0.13 |
|
|
90 |
7.03±0.14 |
1:200 |
7.16±0.14 |
|
|
100 |
7.22±0.15 |
1:400 |
7.15±0.14 |
|
|
Время и кратность экстракции |
||||
|
Время, мин |
Экстракция |
|||
|
1-я |
2-я |
3-я |
||
|
15 |
1.19±0.02 |
0.33±0.01 |
н.о. в |
|
|
30 |
3.15±0.06 |
0.43±0.01 |
н.о. в |
|
|
45 |
4.39±0.09 |
0.87±0.02 |
н.о. в |
|
|
60 |
6.83±0.14 |
1.11±0.02 |
<0.1 |
|
|
75 |
6.83±0.14 |
1.11±0.02 |
<0.1 |
|
|
90 |
6.84±0.14 |
1.11±0.02 |
0.2 |
|
|
105 |
6.83±0.14 |
1.11±0.02 |
0.2 |
|
|
120 |
6.82±0.14 |
1.10±0.02 |
0.2 |
|
|
а образец сырья C h -9 (см. табл. 3); б n = 5; в не определяются. Таблица 2 |
||||
Аттестационная характеристика методики количественного определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях C. Hastate
|
Параметр |
Критерий приемлемости |
||
|
Определенная величина критерия |
Требуемая величина критерия |
Вывод |
|
|
Специфичность |
Recovery = 98.7-103.2% δ = 0.91% |
Recovery = 95-105% δ <3% |
удовлетворяет критерию приемлемости |
|
Правильность |
Recovery = 99.4-102.1% δ = 0.98% |
Recovery = 97-103% δ <3% |
-''- |
|
Повторяемость |
RSD = 1.28% |
RSD <3% |
-''- |
|
Межоперационная точность |
RSD = 1.42% |
RSD <3% |
-''- |
|
Точность |
согласно п.п. 3 и 4 – удовлетворяет критерию приемлемости |
||
С применением разработанной методики было проведено исследование 14 образцов сырья C. has-tata , собранного в 2004-2009 гг. на территории Республики Бурятия (табл. 3). Результаты количественного анализа показали, что суммарное содержание фенилпропаноидов в исследованном сырье в пересчете на хлорогеновую кислоту может составлять 3.34-13.64%.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанная методика может быть использована в практике фармацевтического анализа для количественной характеристики листьев C. hastata .
Суммарное содержание фенилпропаноидов (ФПр) в листьях C. Hastate
|
Номер сырья |
Место сбора |
Дата сбора (ДД.ММ.ГГ) |
Суммарное содержание ФПр, % |
|
C h -1 |
Прибайкальский р-он, с. Горячинск |
10.VIII.2003 |
3.63±1.93 |
|
C h -2 |
Закаменский р-он, с. Бортон |
12.VII.2004 |
13.17±1.60 |
|
C h -3 |
Прибайкальский р-он, с.Хурамша |
27.VII.2004 |
3.34±2.10 |
|
C h -4 |
Мухоршибирский р-он, с. Харашибирь |
27.VII.2004 |
11.14±1.98 |
|
C h -5 |
Мухоршибирский р-он, с. Мухоршибирь |
15.VIII.2004 |
11.24±2.22 |
|
C h -6 |
Мухоршибирский р-он, с. Мухоршибирь |
14.VIII.2005 |
4.25±1.88 |
|
C h -7 |
Прибайкальский р-он, с. Горячинск |
20.VII.2006 |
10.11±2.28 |
|
C h -8 |
Прибайкальский р-он, пос. Тальцы |
25.VII.2007 |
10.73±1.96 |
|
C h -9 |
г. Улан-Удэ |
30.VII.2007 |
8.10±2.10 |
|
C h -10 |
г. Улан-Удэ |
2.VIII.2008 |
7.61±1.97 |
|
C h -11 |
Прибайкальский р-он, с. Горячинск |
14.VII.2009 |
13.64±2.27 |
|
C h -12 |
Мухоршибирский р-он, с. Мухоршибирь |
20.VII.2009 |
6.42±2.18 |
|
C h -13 |
Прибайкальский р-он, с. Татаурово |
25.VII.2009 |
11.88±1.94 |
|
C h -14 |
Прибайкальский р-он, с. Горячинск |
31.VII.2009 |
12.31±2.03 |
Заключение
-
1. Изучены условия экстракции и спектрофотометрического определения фенилпропаноидов в листьях Cacalia hastata L.
-
2. Разработана методика количественного определения фенилпропаноидов в листьях C. hastata в пересчете на хлорогеновую кислоту.
-
3. Параметры специфичности, повторяемости, правильности, межоперационной точности и точности удовлетворяют требованиям соответствующей нормативной документации.
