Спектрофотометрический контроль соединения оптически прозрачных материалов и тонких слоев

При создании биоаналитических и микрофлю-идных устройств (МФУ) одной из важных задач является целевая модификация поверхности для обеспечения прочной фиксации биологически чувствительного слоя или иммобилизации геля (например, для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в среде геля) [1, 2]. Как в случае физической, так и при химической обработке поверхности меняются ее свойства за счет появления функциональных групп, изменения топологии и т. д. Модификация поверхности в общем случае может оказывать существенное влияние на аналитические характеристики биосенсорных и микрофлю-идных устройств. А отсутствие регламентированных или общепринятых способов контроля свойств поверхности при изготовлении этих устройств приводит к высокому проценту некачественных изделий или к существенному разбросу их характеристик. Необходимость контроля соединения тонких чувствительных слоев с подложкой обусловлена тем, что слой, плохо связанный с поверхностью, ухудшает функциональные характеристики устройства и приводит к невоспроизводимым результатам измерений. Оптические методы позволяют осуществлять неразрушающий и оперативный контроль однородности слоев (например, методы эллипсометрии [3, 4]), измерять толщину слоя и оптические показатели [5] и т. д. Методы эллипсометрии и интерферометрии позволяют осуществлять измерения достаточно тон- ких слоев (толщиной до 10 мкм), но при этом предъявляются высокие требования к исследуемым образцам. Поэтому они не подходят для решения ряда практических задач, в которых требуется измерение слоев толщиной от единиц до нескольких десятков микрометров, причем слои могут быть неоднородными (полимеры и гели).

В данной работе предложен методический подход, основанный на измерении светопропускания тонких слоев на оптически прозрачной подложке и позволяющий оценивать качество фиксации тонкослойных пленок на субстрате. Метод контроля был апробирован при оценке качества иммобилизации полиакриламидного геля в реакционной камере микрочипа из полиметилметакрилата (ПММА) марок ТОСП ( ГОСТ 17622-72, ТУ 2216-271-05757593-2001) и ACRYMA^®72 (ТУ 2216-030-55856863-2004) для ПЦР в гелевой среде [6].

ОЦЕНКА СВЕТОПРОПУСКАНИЯ СИСТЕМЫ (ТОНКИЙ СЛОЙ—ПОДЛОЖКА)

Основной идеей контроля качества прилегания чувствительного слоя является следующее положение: при плотном прилегании слоя (пленки) 1 к подложке 2 формируется двухслойная система (рис. 1, а), а при непрочном — образуется трехслойная система с воздушным (или иным) зазором 3 (рис. 1, б). Это приводит к появлению дополнительных границ раздела сред и изменениям пропускания и отражения образца, которые могут

б

Рис. 1. Пропускание и отражение светового потока от двухслойной (а) и трехслойной (б) систем.

а — пленка 1 плотно связана с поверхностью подложки 2; б — между пленкой и подложкой находится слой воздуха 3, создающий дополнительные границы раздела сред.

I 0 — интенсивность падающего светового потока; I R(2) и I R(3) — интенсивности отраженного потока для двухслойной и трехслойной системы соответственно; I L(2) и I L(3) — интенсивности прошедшего потока для двухслойной и трехслойной системы соответственно

быть зарегистрированы фотометрическим методом.

Важной особенностью таких измерений является выбор спектрального участка, в котором пропускание материала подложки и прилегающего слоя максимально велико. В этом случае можно рассчитать теоретические оценки для подобных измерений, предполагая, что световой поток падает перпендикулярно поверхности слоя, а слой и подложка рассматриваются как плоскопараллельные пластины.

Для случая трехслойной системы, когда слой воздуха находится между пленкой и подложкой, общее светопропускание можно определить, как произведение светопропусканий тонких пластин с разными показателями преломления и, следовательно, с разным отражением от границ раздела сред:

_{T Т/Т} _ (1 - R 10 ) ² exp ^(- « 1 h ) _у T L ⁽³⁾ T ¹ T ²     1 - R ₁ ² ₀exp ( - 2 « 1 h )

_x ( 1 - ^R 20 ) ² exP ( - « 2 ^h 2 )

1 - R 2 exp ( - 2 « ₂ h ₂ )

где R 10 и R 20 — коэффициенты отражения от границы раздела сред пленка—воздух и подложка—воз-дух (если пластины находятся в воздушной среде); α 1 и α 2 — коэффициенты поглощения; h 1 и h 2 — толщины пленки и подложки соответственно.

Если выбрать спектральный диапазон измерений, в котором поглощением подложки можно пренебречь, то

_T = ( 1 ^{- R} 10 ) ² exP ( — « 1 ^h 1 ) _x ( 1 ^{- R} 20 ) ²       ₍ 1)

L ⁽³⁾     1 - R ₁ ² ₀exp ( - 2 « 1 h 1 )      1 - R ₂ ² ₀ ^.

Оценка отражения света от границы раздела сред i и j может быть получена по известной формуле

Rj =( n- nj) /(п + nj)2, где ni — показатель преломления среды i, nj — показатель преломления среды j.

Для двухслойной системы (пленка—подложка) с общей границей раздела прошедший световой поток будет определяться суммарным потоком, вызванным многократными переотражениями от границ раздела сред. Предположив, что поглощением подложки можно пренебречь, в первом приближении можно оценить светопропускание такой системы как

I

T l (2) = ^^ - ( 1 - R 01 )( 1 - R 12 )( 1 - R 20 T x

I ₀

x { 1 + R 12 R 20 + [ R 12 R 10 + R 10 R 20 ( 1 - R 12 ) ² ] T } .   (2)

Рис. 2. Зависимости светопропускания T двухслойной ТL(2) и трехслойной TL(3) систем от пропускания τ слоя полиакриламидного геля на подложке из полиметилметакрилата

Здесь т ₁ = exp( - а ₁ h ₁ ) , R ₀₁ = R ₁₀, R 12 — коэффициент отражения от границы раздела сред пленка— подложка

На рис. 2 представлены зависимости светопро-пускания для двухслойной и трехслойной систем от поглощения слоя, вычисленные по формулам (1) и (2) на примере слоя акриламидного геля (ngel=1.525) и подложки из полиметилметакрилата (nPMMA=1.488). Показатели преломления определялись на длине волны λ = 632.8 нм. Чем больше поглощение слоя, тем меньше отличие в светопро-пускании рассматриваемых систем. Поэтому наиболее надежные оценки, характеризующие качество прилегания слоя к подложке можно получить в случае слабого поглощения слоя. Следует также учитывать, что в реальном случае измерения осуществляются в определенной пространственной области, и, следовательно, получаемые результаты содержат данные о некоторой поверхности измерений. На локальных участках поверхности может наблюдаться неравномерное прилегание слоя к подложке. Таким образом, точность получаемых оценок будет зависеть от соотношения площадей областей неплотного и плотного прилегания, а также области детектирования. Особенностью предлагаемого подхода является то, что для получения точных оценок необходимо знать значения показателя преломления слоя и подложки. При модификации и обработке поверхности значения показателя преломления обработанных слоев могут не соответствовать табличным, поэтому в не- которых случаях необходимо проведение дополнительных измерений, например, эллипсометрическими методами.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ИММОБИЛИЗАЦИИ ГЕЛЯ

НА ПОДЛОЖКЕ

Для экспериментальных исследований были изготовлены прототипы полимерных микрочипов из ПММА размером 24 × 24 мм, представляющие собой двухслойную систему — подложку и пластину с отверстием (диаметр 6.5 мм, глубина 1 мм), которые соединены между собой адгезивом толщиной 50 мкм (фирма 3М, США). Такой метод является оперативным и универсальным для исследовательских лабораторий и позволяет за короткое время осуществить изготовление пилотных образцов устройства. Подобный подход для создания микрочипов для ПЦР в жидкой среде был предложен в работе [7].

Для иммобилизации полиакриламидного геля в реакционной камере двухслойного микрочипа применялись следующие способы модификации поверхности ПММА с целью получения гидроксильных групп: для марки ТОСП — реакция гидролиза в кислой среде (обработка 3М серной кислотой с предварительной промывкой в 30 %-м этиловом спирте), для марки ACRYMA — плазменная обработка в среде аргона. За основу процедур иммобилизации и отливки геля был принят протокол для стеклянных поверхностей, который содержал стадии силанизации и полимеризации акриламида [6].

После высыхания геля чипы исследовались спектрофотометрическим методом. Идеальным случаем являлась бы ситуация, когда спектральная зависимость светопоглощения слоя геля отличалась бы от поглощения материала чипа (ПММА). Но акриламидный гель и ПММА имеют схожие спектральные зависимости в видимом диапазоне. Толщина высохшего геля составляет десятки микрометров, а толщина ПММА в области реакционной камеры 1 мм. В этом случае необходимо проведение относительных измерений, когда в канале сравнения спектрофотометра установлен чип без слоя геля. Относительные измерения также позволяют в некоторой степени исключить влияние возможной вариации толщины подложки — пластины ПММА — на экспериментальные данные.

После полимеризации гель представляет собой тонкий слой, обладающий светорассеивающими свойствами, поэтому следует учитывать ослабление светового потока слоем геля. Оценка τ gel была определена экспериментально и составила τ gel = = 0.86.

Используя значения показателей преломления слоя силана на поверхности полимеров двух марок до и после обработки, полученные эллипсометрическим методом, по формулам (1) и (2) можно вычислить теоретические оценки светопропускания для двухслойной (случай качественной фиксации геля) и трехслойной системы (содержащей слой воздуха).

Для образца из ПММА марки ТОСП после химической обработки и силанизации поверхности теоретические оценки составили: для двухслойной системы T L(2) ≈ 0.793, для трехслойной — T L(3) ≈ ≈ 0.729.

Разность между этими оценками ( T L(2) – T L(3) = = 0.064), что составляет 6.4 % пропускания и может быть зарегистрирована фотометрическим методом. При спектрофотометрических измерениях геля, иммобилизованного на ПММА марки ТОСП (вариант химической обработки), было получено значение T L ≈ 0.791, близкое к теоретическому значению T L(2) , что позволяет сделать вывод о плотном прилегании слоя геля к поверхности реакционной камеры.

Для образца из ПММА марки ACRYMA (для плазменной обработки в среде аргона с последующей силанизацией) теоретические оценки составили: для двухслойной системы T L(2) ≈ 0.768 и для трехслойной системы T L(3) ≈ 0.706. При спектрофотометрических измерениях геля, иммобилизованного на ПММА, марки ACRYMA было получено значение T L ≈ 0.661, соответствующее случаю неплотного прилегания геля.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Теоретически и экспериментально показано, что использование оптической спектроскопии в видимой области спектра позволяет контролировать качество иммобилизации гелевой среды в реакционной камере микрочипового устройства из полимерного материала, что дает возможность снизить число некачественных изделий при создании микрочипов и улучшить их аналитические характеристики.

На основании экспериментально полученных оценок светопропускания микрочипов из ПММА двух марок с гелем можно сделать вывод о том, что наиболее эффективным и надежным методом предварительной обработки, позволяющим получить систему с плотно прилегающим тонким слоем геля, является реакция гидролиза в кислой среде образца марки ТОСП.

Предложенный вариант неразрушающего контроля качества фиксации тонкого чувствительного слоя к подложке методом оптической спектроскопии в видимой области спектра является перспективным и экспрессным и может применяться при создании биосенсорных и микрофлюидных устройств.

Работа выполнена при поддержке ФЦП ФМБА "Национальные системы химической и биологической безопасности РФ", проект "Разработка методик регистрации результатов цифровой полимеразной цепной реакции и технологий создания микрочиповых устройств для ее постановки".