Сперма хряков: особенности и способы хранения (обзор)

Свиноводство — это крупная сельскохозяйственная отрасль, которая служит одним из масштабных поставщиков мяса и продуктов убоя благодаря ряду биологических особенностей свиней (1): высокой плодовитости

(2, 3) и мясной продуктивности (4), скороспелости и всеядности (5-7), а также высокой калорийности мяса (8).

В современной животноводческой отрасли Российской Федерации значительная доля приходится на свиноводство. С 2005 года прослеживается тенденция роста поголовья животных (9), что связано со строительством и вводом в эксплуатацию новых и прошедших реконструкцию предприятий. В 2020 году было произведено 5472,2 тыс. т живой массы свиней, а в 2021 году — 5496,2 тыс. т, что составило соответственно 35 и 37 % от общей доли производства скота и птицы (10). Предполагается, что к 2025 году производство свинины в России составит 6 млн т живой массы (11).

Для разведения свиней на животноводческих предприятиях и в фермерских хозяйствах применяют естественное и искусственное осеменение. Так, в настоящее время искусственное осеменение используется для разведения более 90 % свиноматок в большинстве стран мира (12), в том числе в свиноводческих хозяйствах РФ (13, 14).

Искусственное осеменение играет важную роль в улучшении генофонда, продуктивности, а создание центров искусственного осеменения позволяет проводить отбор племенных хряков на фертильность и получать сперму высокого качества (15). В связи с этим в последнее десятилетие актуальным научным направлением становится изучение методов обнаружения субфертильных животных, приемов прогнозирования фертильности хряков, а также способов выявления хряков, сперма которых имеет более высокую степень криорезистентности с последующим определением репродуктивных показателей (16). Важно отметить, что криоконсервация спермы вызывает изменение структуры сперматозоидов, снижение подвижности, жизнеспособности и митохондриальной функции (17). В условиях in vitro коэффициент оплодотворения размороженной спермой составляет около 38,5 % (18), частота образования бластоцист при использовании карбокси-лированного поли-L-лизина в качестве криопротектора — 24,6 % (19), тогда как показатели стельности и опороса достигают соответственно 84,2 и 81,6 % (20). Криоконсервация спермы помогает сохранять ценный генетический материал, а также способствует быстрому генетическому обновлению поголовья, в связи с чем важная роль отводится разработке методов, обеспечивающих поддержание структуры половых гамет в процессе замораживания (21).

Стоит выделить еще одно интересное и перспективное направление в свиноводческой отрасли — производство сексированной спермы, что позволяет получать большое число животных женского пола с сохранением фертильности семени (12, 22, 23).

Таким образом, в развитии свиноводства одной из главных задач становится повышение эффективности искусственного осеменения, а значит, улучшение качества спермы от высокоценных хряков-производителей.

Цель нашего обзора — систематизировать научно-производственные данные об особенностях спермы хряков, способах ее хранения и методах криоконсервации.

Сперматогенез — это регулируемый процесс размножения и дифференцировки половых клеток, приводящий к образованию сперматозоидов в семенных канальцах (24). Сперматогенез состоит из четырех стадий: размножение, рост, формирование и созревание. На этих этапах происходит митотическое и мейотическое деление клеток, в результате чего образуются гаплоидные половые клетки — сперматозоиды (24, 25), которые приобретают фертильность поэтапно. Немаловажное значение имеет придаток семенника. В нем происходит созревание сперматозоидов, во время которого половые клетки контактируют с внеклеточными микровезикулами (эпиди-722

димосомами), способными снабжать сперматозоиды новым набором белков, модулирующих протеом клеток и участвующих в их посттестикулярном созревании (26, 27). Второй составной частью спермы служит вырабатываемая придаточными половыми железами семенная плазма, в состав которой входит большое количество органических и неорганических веществ с различной концентрацией в зависимости от вида животного (28).

Сперма хряков имеет видовые особенности, такие как объем эякулята, морфология сперматозоидов, сниженная криорезистентность спермы.

Как известно, объем эякулята, то есть количество спермы, выделяемой во время полового акта, имеет существенные видовые различия. Средний объем эякулята у хряка составляет 100-150 мл (29). Придаточные половые железы хряков более развиты, чем у других животных, и их секреция больше, чем, например, у быков и баранов (30).

Объем эякулята хряков варьируется в зависимости от породы, возраста, сезона года и других параметров. L. Zasiadczyk с соавт. (31) определили, что этот показатель существенно изменяется в течение года: в осеннезимний период объем фракционированного эякулята составлял в среднем 107,78 мл, тогда как в весенне-летний период — 87,8 мл (31). Эти данные подтвердили L. Fraser с соавт. (32), установив, что объем эякулята у хряков старше 18 мес в осенне-зимний период составляет 238 мл.

Объем эякулята имеет обратную зависимость с концентрацией сперматозоидов. Так, концентрация сперматозоидов в сперме хряка составляет среднем 0,1-0,4 млрд/мл, или 3-7 %, а остальная часть представлена секретом придаточных половых желез (33). Объем эякулята хряков может определять морфометрические параметры сперматозоидов. K. Gorski с соавт. (34) установили, что сперматозоиды в эякулятах наименьшего объема (менее 160 мл) имели головки большей длины и ширины, а сперматозоиды из эякулятов с наибольшим объемом (более 200 мл) — более длинные хвосты. Наименьшее число морфологически нормальных сперматозоидов обнаруживалось в эякулятах наибольшего объема: (на 4 % меньше, чем в эякулятах, объем которых варьировался от 161 до 200 мл, и на 2,56 % меньше, чем в эякулятах объемом менее 160 мл) (34).

Сперматозоиды хряка морфологически схожи со сперматозоидами других копытных животных. Согласно морфометрическим исследованиям, проведенным V. Barquero с соавт. (35), сперматозоиды хряков, полученных в результате скрещивания пород дюрок и пьетрен, имеют длину головки 8,77 мкм, ширину 4,54 мкм, площадь 35,46 мкм, шероховатость 0,75 4 A/P2.

Морфологическую оценку сперматозоидов проводят с помощью различных красителей, состав и свойства которых могут влиять на получаемый результат. Так, M. Czubaszekс соавт. (36) выявили, что использование красителя Sperm Blue в наименьшей степени влияет на морфометрические параметры головки сперматозоида, тогда как окрашивание нитратом серебра в коллоидном растворе желатина оказывает значительное влияние на морфометрические характеристики, но при этом позволяет поводить морфологическую оценку и идентификацию некоторых структур сперматозоида. Похожие результаты были получены D. Szablicka с соавт. (37).

S.T. Kondracki с соавт. (38) установили, что сперматозоиды, окрашенные эозин-нигрозином, имели меньшие размеры, а также более короткие и узкие головки, чем сперматозоиды, окрашенные эозин-горечавковым красителем. Для морфологической оценки сперматозоидов используют также красители Дифф-Квик (39) и окрашивание по Романовскому-Гимзе (40).

Морфология сперматозоидов может зависеть не только от объема эякулята, но и от породы хряка. K. Gorski с соавт. (41) определили, что сперматозоиды хряков породы ландрас имели головки на 0,15 мкм и жгутик на 2,07 мкм длиннее, чем сперматозоиды хряков крупной белой породы (41).

Таким образом, сперма хряков имеет ряд видовых особенностей, на которые оказывают влияние порода, сезон года, возраст животных и другие параметры.

Сперма хряков также обладает повышенной чувствительностью к низким температурам, то есть к криоконсервации, которая вызывает физиологические и функциональные изменения в сперматозоидах (42, 43). Во время криоконсервации клетки подвергаются осмотическому стрессу и дегидратации, возникает повреждение акросом, изменяется проницаемость мембраны, в результате этого снижается подвижность и жизнеспособность размороженных сперматозоидов (44, 45). Кроме того, процесс замораживания-оттаивания способен вызывать окислительный стресс и увеличить образование активных форм кислорода и азота (46). В обзоре P. Peris-Frau с соавт. (47) указано, что во время замораживания происходит накопление активных форм кислорода, которые задерживаются в плазматической мембране и вызывают окислительный стресс. Это приводит к белковым, липидным и углеводным изменениям в мембране сперматозоидов из-за нарушения дисульфидных связей между мембранными белками (47). Индуцировать окислительный стресс в мембране сперматозоидов могут и липополисахариды клеточной стенки бактерий (48). Образование активных форм кислорода и азота ухудшает качество спермы. Различные вещества семенной плазмы, такие как спермин и спермидин, способствуют снижению содержания активных форм кислорода и повышению качества сперматозоидов (49, 50).

Как известно, устойчивость к замораживанию, или криорезистентность, неодинакова у разных видов животных. Так, после оттаивания спермы быка доля подвижных сперматозоидов достигала примерно 38 % (51), а у хряка после размораживания и трехчасовой инкубации подвижность сперматозоидов составляла 19 % (52). Низкая устойчивость к замораживанию также отражается на длительности хранения замороженной спермы. J. Li с соавт. (53) отмечают, что продолжительность хранения не влияет на жизнеспособность сперматозоидов. Вместе с тем были зарегистрированы низкие показатели подвижности в образцах спермы, хранившихся в течение 4 и 8 лет (53). В отличие от спермы хряков, срок хранения криоконсервиро-ванной спермы быков может достигать 18 лет без существенного снижения подвижности и с сохранением фертильности (54). Низкую криорезистентность спермы хряка связывают с более высокой концентрацией фосфолипидов и более низким содержанием холестерина в плазматической мембране сперматозоидов, а также с более крупными размерами головок сперматозоидов (43). Состав плазматической мембраны сперматозоидов может варьироваться в сперме с хорошей и плохой замораживаемостью. Y. Zhang с соавт. (55) проанализировали липидный состав плазматических мембран сперматозоидов хряков с хорошей и плохой замораживаемостью. Липидный состав плазматических мембран показал различие в количестве 15 липидов между этими группами. К наиболее распространенным фосфолипидам в плазматической мембране относят фосфатидилхолин, который связан с подвижностью сперматозоидов и участвует в акросомальной реакции; фосфа-тидилсерин, оказывающий влияние на целостность мембран; фосфатидилинозитол, который служит сигнальным фактором в клетках (56).

Холестерин повышает стабильность мембраны при понижении температуры, тем самым уменьшая степень повреждения. При этом ключевое значение имеет соотношение холестерина и фосфолипидов. Так, спермато-724

зоиды животных, более устойчивые к криоконсервации, имеют большее молярное соотношение холестерина и фосфолипидов (57). Этот факт был продемонстрирован в работе M. de las Mercedes Carro с соавт. (58): при наличии демостерола и холестерина в сперме барана ее криорезистентность увеличивалась.

Следовательно, можно утверждать, что состав плазматической мембраны играет важную роль в устойчивости сперматозоидов к низким температурам. D.B. Guimaraes с соавт. (59) определили, что потенциальными маркерами замораживаемости спермы хряков выступают белки мембран сперматозоидов: Fc-фрагмент IgG-связывающего белка, лактадгерин, арилсульфатаза А и субъединица альфа-1 белка, покрывающего F-актин. В связи с этой особенностью оптимальный режим хранения спермы хряков — температура от 17 до 25 ° С, продолжительность — не более 120 ч (60).

Установлены параметры, которые повышают устойчивость сперматозоидов хряка к низким температурам. В обзорной статье M. Yeste (61) отмечается, что качественные характеристики спермы, полученной в зимний и весенний период, обусловливают ее более высокую криорезистентность. Другие исследования подтверждают колебания подвижности сперматозоидов в течение года с ее выраженным ухудшением весной и летом (62), что D. Martin-Hidalgo с соавт. (63) связывают с количеством белков, обнаруженных в сперме. В эякулятах, собранных в летнее время, количество белков, отвечающих за сперматогенез, подвижность сперматозоидов, акро-сомальную реакцию и оплодотворение, было меньше, чем в эякулятах, собранных зимой (63). Протеомный анализ в исследовании I. Parrilla с соавт. (64) выявил наличие белков сперматозоидов и семенной плазмы, связанных с различными показателями. Например, белок семенной плазмы Galactosidasebeta 1-like 3 (GLB1L3) связан со стабильностью и проницаемостью мембран сперматозоидов, белок Alpha-enolase (ENO1) оказывает влияние на их подвижность.

Неоднозначным вопросом остается центрифугирование спермы перед замораживанием. H.H. Shiomi с соавт. (65) отмечают, что при режиме центрифугирования 2400 об/мин в течение 3 мин сперматозоиды повреждаются меньше, чем при 800 об/мин в течение 10 мин, следовательно, остаются более устойчивыми к повреждающему действию холода. Оптимальные режимы центрифугирования могут варьироваться в зависимости от вида животных. H. Chakravarty с соавт. (66) установили, что качественные характеристики сперматозоидов козла выше при 1400 об/мин в течение 5 мин и 1100 об/мин в течение 8 мин по сравнению с 700 об/мин в течение 8 мин. Результаты, полученные T. Nongbua с соавт. (67), указывают на эффективность применения однослойного центрифугирования спермы быка в течение 20 мин при 300 об/мин для сохранения жизнеспособности сперматозоидов после оттаивания.

Что касается использования семенной плазмы хряков в процессе криоконсервации, то успешность хранения главным образом зависит от компонентов плазмы. Так, основной белок семенной плазмы хряков PSPI негативно влияет на сперматозоиды, а спермадезин PSP-I, напротив, улучшает их способность к оплодотворению (68). Предполагается, что белки фракционированной семенной плазмы оказывают положительное воздействие на мембрану сперматозоидов, что приводит к повышению криорезистентности (69). C. Luongo с соавт. (70) продемонстрировали, что хранение сперматозоидов в семенной плазме при 16 °С в течение 3 сут не ухудшает качество сперматозоидов. В то же время A.P.P. Pavaneli с соавт. (71), напротив, регистрировали ухудшение качественных показателей сперматозоидов при хранении в семенной плазме и снижение оплодотворяемости свиноматок. Результаты J. Li с соавт. (72) указывают на успешное использование первой семенной фракции в объеме 10 мл в процессе криоконсервации сперматозоидов. J. Li с соавт. (73), а также K. Wasilewska-Sakowska с соавт. (74) получили положительные результаты при добавлении семенной плазмы к сперматозоидам до и после криоконсервации. В связи с этим необходимо отметить, что вопрос влияния семенной плазмы на сохранность сперматозоидов хряков остается открытым, поскольку некоторые исследования демонстрируют противоположные результаты.

К факторам, влияющим на устойчивость спермы хряков к замораживанию, относятся разбавители. В настоящее время для разведения и последующей криоконсервации спермы хряков используют разбавители CryoGuard («Minitube», Германия), Androstar Plus («Minitube», Германия), An-drohep Plus («Minitube», Германия), Safecell Plus («IMV», Франция), TRIX-cell Plus («IMV», Франция), BTS («IMV», Франция) (75). Состав разбавителей может варьировать в зависимости от производителя, однако среды для разбавления обычно включают сахара (глюкоза, фруктоза и др.), используемые в качестве источника энергии для сперматозоидов и снижающие электропроводность, соли многоосновных кислот для предотвращения окисления сперматозоидов, яичный желток для снижения действия холодового шока, а также антибиотики, витамины, глицерин и другие вещества (76). Например, для разбавления спермы хряков может использоваться глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная (ГХЦС) среда, которая сохраняет двигательную активность сперматозоидов даже при длительном хранении, а также способствует высокой оплодотворяемости свиноматок (77-79). A. De Andrade с соавт. (80) отмечают, что показатели прогрессивной подвижности сперматозоидов, целостности акросомы и плазматической мембраны сперматозоидов были лучше в сперме, разбавленной CryoGuard, по сравнению со спермой, разбавленной Androstar Plus. В статье A. Dziekonska с соавт. (81) приведены результаты оценки разбавителей BTS, Androhep Plus и Gedil («IMV», Франция), при этом самое высокое качество спермы после размораживания отмечали при использовании Androhep Plus.

R. Dong с соавт. (82) отмечают, что добавление к сперме 10 мкм рибофлавина повышает целостность акросомы, плазматической мембраны, снижает степень фрагментации ДНК, а также содержание малонового диальдегида. Другими веществами, положительно влияющими на качество замороженной спермы, считаются пентаизомальтоза (83), трегалоза, при использовании которой оплодотворяемость in vitro составила 66 % (84), апе-генин, феруловая кислота (85), трис(гидроксиметил)аминометан (86), ресвератрол (87).

Время охлаждения — это параметр, влияющий на криорезистентность сперматозоидов. K. Wasilewska с соавт. (88) установили улучшение подвижности при эквилибрации спермы при 10 ° С в течение 24 ч. M.A. Torres с соавт. (89) также указывают, что 24-часовая эквилибрация спермы при 17 ° С улучшает качество оттаянных сперматозоидов. Однако в других исследованиях оптимальным временем охлаждения были 2-4 ч при 5 ° С (90, 91).

Успешность криоконсервации во многом определяется протоколом глубокой заморозки спермы. Существует большое число успешных протоколов криоконсервации. Так, V. Khophloiklang с соавт. (92) указывают на успешность заморозки, при которой соломинки со спермой помещали в пенополистирольную коробку на 4 см выше уровня жидкого азота на 20 мин, а затем погружали в жидкий азот (92). Во многих других исследованиях использовалась похожая методика замораживания с различиями в расстоянии 726

расположения соломинок над парами азота или во времени их выдерживания. Например, S. Bang с соавт. (93) помещали соломинки горизонтально на 2 см над поверхностью жидкого азота и выдерживали в течение 15 мин. В статье S.L. Soares с соавт. (94) указано 20-минутное выдерживание на расстоянии 5 см. В большинстве этих исследований подвижность и жизнеспособность сперматозоидов сохраняется, однако M.G. Philippe с соавт. (95) указывают на отрицательный результат применения протокола заморозки, включающего размещение соломинок на расстоянии 5 см над жидким азотом в течение 10 мин, а затем их полное погружение в жидкий азот. При этом сперматозоиды после размораживания имели низкие параметры подвижности (95). Может применяться витрификация спермы в соломинках, то есть ее быстрое замораживание. M.S. Albal с соавт. (96) установили, что витрификацию допустимо использовать для криоконсервации спермы хряка, поскольку сперматозоиды сохраняют свою подвижность, однако ступенчатое замораживание в настоящее время более предпочтительно.

Другой способ криоконсервации — автоматическая заморозка, которая имеет ряд преимуществ. Так, F. Pezo с соавт. (97) для автоматизированного замораживания использовали оборудование Icecube 11XS («SY-LAB Geräte GmbH», Австрия). Скорость изменения температуры в течение 100 с составляла 6 ° С • мин - 1 , благодаря чему температура снижалась от 5 до - 5 ° C, затем температура снижалась со скоростью - 39,80 ° С • мин ^{- 1} в течение 113 с. После этого сперму выдерживали при - 80 ° C в течение 30 с и замораживали со скоростью - 60 ° С • мин ^{- 1} в течение 70 с для того, чтобы температура в конечном итоге снизилась до - 150 ° C. Было установлено, что подобный режим криоконсервации снижает количество свободных радикалов, перекисное окисление липидов и транслокацию фосфатидилсерина, что отражается на сохранении подвижности с течением времени (97).

Подобные протоколы автоматической заморозки с различными кривыми снижения температуры использовались и в других исследованиях (98, 99). Таким образом, процесс замораживания спермы — это важный этап, поскольку от способа его проведения зависит качество оттаянной спермы.

Ключевые факторы при проведении процедуры размораживания спермы — температура и время. R.V. Knox с соавт. (100) продемонстрировали, что размораживание при 70 °C в течение 20 с снижало показатели подвижности, жизнеспособности и число сперматозоидов с интактными акросомами (100). M.A. Thema с соавт. (101) определили оптимальную температуру для оттаивания спермы хряков породы Windsnyer, составившую -40 °C. В работе C. Tomas-Almenar с соавт. (102) оптимальное качество спермы иберийских свиней достигалось при размораживании при 70 °C в течение 80 с при добавлении в сперму циклодекстринов. Как и при замораживании, время и температура размораживания — вариабельные показатели, зависящие от установленного протокола оттаивания: 8 с при 60 °C (103), 8 с при 70 °C (104), 25 с при 37,5 °C (105). Нестандартным протоколом оттаивания было предварительное размораживание на воздухе в течение 10 с, а затем оттаивание на водяной бане при 37 °C в течение 1 мин, при этом оплодотворяемость размороженного семени в условиях in vitro составила 31,94-48,72 % (106). R. Fernandez-Gago с соавт. (107) установили, что добавление 50 % семенной плазмы от хряков с хорошей фертильностью в размороженную сперму улучшает подвижность оттаянных сперматозоидов, а также сохраняет структуру хроматина. После размораживания сперму сохраняют при различных температурах. J. Li с соавт. (108) определили, что -17 °C — наиболее благоприятная температура для хранения оттаянных сперматозоидов. Исследователи отмечают, что при такой температуре снижается степень апоптоза и количество активных форм кислорода.

Итак, несмотря на широкое использование искусственного осеменения, в свиноводстве криоконсервация семени применяется редко в связи с особенностями спермы хряков, а именно с ее низкой криорезистентностью, что обусловлено высокой концентрацией фосфолипидов, низкой концентрацией холестерина в плазматической мембране сперматозоидов и крупными размерами головок сперматозоидов. Тем не менее в ряде исследований по повышению устойчивости спермы хряков к замораживанию подучены положительные результаты. Так, центрифугирование спермы при 2400 об/мин в течение 10 мин с последующим удалением семенной плазмы повышает криорезистенстность сперматозоидов при глубокой заморозке. Наиболее эффективными криопротекторами для спермы хряков считаются разбавители CryoGuard и Androhep. Повышение криотолерантности наблюдается также при добавлении рибофлавина, пентаизомальтозы, трегалозы в сперму перед охлаждением с последующей заморозкой. Оптимальное время охлаждения спермы варьирует, однако положительные результаты были получены при охлаждении спермы в течение 24 ч при 17 ° С, а также в течение 2-4 ч при 5 ° С. Протокол криоконсервации имеет важное значение для сохранения жизнеспособности и подвижности сперматозоидов после оттаивания. В ряде исследований установлен оптимальный протокол ручной заморозки спермы — горизонтальное размещение соломинок со спермой на 4 см выше уровня жидкого азота на 20 мин с дальнейшим погружением в жидкий азот, а также на 2 и 5 см и соответственно на 15 и 20 мин. При автоматическом замораживании спермы снижается количество свободных радикалов и перекисное окисление липидов, что отражается на сохранении подвижности клеток с течением времени. Оптимальный протокол автоматической заморозки спермы включает снижение температуры от 5 до - 5 ° C и далее со скоростью - 39,80 ° С • мин ^{- 1} в течение 113 с. После этого сперму выдерживают при - 80 °C 30 с и замораживают со скоростью - 60 ° С • мин ^{- 1} в течение 70 с, чтобы температура в конечном итоге снизилась до - 150 ° C. В настоящее время разработано несколько протоколов оттаивания спермы хряков: 8 с при 60 ° C, 8 с при 70 ° C, 25 с при 37,5 ° C. Хранение оттаянной спермы рекомендуется проводить при температуре 17 ° C, что снижает степень апоптоза и содержание активных форм кислорода.