Способ деконтаминации ростовых сред и стимуляции метаболизма культур клеток с использованием У- лучей

Производство лечебнопрофилактических препаратов требуют применения ростовых сред, свободных от контаминантов микроорганизмов различных видов и штаммов. Важное значение при культивировании клеток имеет чувствительность и устойчивость к различным факторам внешней среды: температуре, давлению, ионизирующим изучениям, концентрации солей, рН, токсикантам, антибиотикам, фитонцидам, эндотоксинам и т.д.

Изучение радиочувствительности микроорганизмов напрямую связано с использованием ионизирующей радиации для лучевой стерилизации медицинских инструментов, препаратов и обработки пищевой продукции [4].

Радиационная обработка с целью стерилизации плазмы крови, а также ее замороженной и лиофилизированной фракций, способствовала сохранению биологической активности препаратов. Учитывая изложенное, замороженную и лиофилизированную сыворотку крови, а также и γ-глобулин подвергали радиационной обработке γ-лучами в дозах 1,5-2,5×106 Р. Установлено, что облучение существенно снижает активность иммунного γ-глобулина. Гамма-облучение полностью переводит протеины в нерастворимое состояние, и агрегируют иммуноглобулин класса G.

Установлено, что одним из механизмов противолучевой защиты на фоне применения радиопротекторов, в частности иммунотропных препаратов, является усиление активности макрофагов, моноцитов и нейтрофилов, ограничивающих экспансию условнопатогенной микрофлоры в условиях депрессии кроветворной и иммунной системы [6]. Облучение плазмы крови и отдельных ее фракций ускоренными электронами в дозе 1×106 Р вызывает полное уничтожение вируса гепатита, снижает концентрацию альбумина и увеличивает содержание γ-глобулина, одновременно снижая концентрацию фибриногена, т.е. меняет соотношение белковых фракций. Доза γ-квантов 137Cs 2×106 Р вызывает полную инактивацию специфических антител в облученной плазме крови иммунизированных людей. Радиостерилизация плазмы в дозах 1-2×106 Р понижает содержание титра комплемента на 43 % и увеличивает протромбиновое время.

Облучение фибриногена γ-лучами в дозе 5×105 Р и более заметно снижает его растворимость и активность, а облучение в дозе 1,5-3,5×106 Р снижает свертывающую активность тромбина. Влияние радиации в дозах до 5 Мрад на фибринную губку не меняет ее гемостатистические свойства.

Влияние ионизирующего эффекта на активность антител открывает возможность радиационной стерилизации лечебных, профилактических и диагностических сывороток крови. По данным исследователей, изучавших влияние облучения в дозах 0,6 и 1,5×106 Р на антитоксические, анафилактические и электрофоретические свойства противодифтерийных сывороток, радиооблучение частично денатурирует сывороточные белки крови, уменьшает анафилактические свойства сыворотки и заметно снижает титр антитоксина. На наличие денатурации указывает повышение ее вязкости, изменение соотношения белковых фракций сыворотки и изменение их электрофоретической характеристики. Облучение с целью стерилизации диагностических сывороток незначительно снижает титр агглютининов. При этом иммунные свойства не теряют превентивность после лучевого воздействия. На лиофильно высушенные сыворотки радиация не оказывает существенного влияния. По-видимому, с уменьшением стерилизующей дозы изменения, возникающие в белковых растворах, сыворотке и плазме крови, в препаратах крови несущественны. Поэтому уменьшение доз не обеспечивает полной стерилизации. Учитывая изложенное, для стерилизации препаратов крови и сывороток используют комбинированные способы, которые при снижении дозы облучения не уменьшали бы бактерицидного эффекта ионизирующих излучений. Такое условие соблюдается при применении комбинированного терморадиационного способа стерилизации, когда производится одновременное прогревание и облучение. При терморадиационном способе стерилизации предусматривается прогревание объекта от плюс 50 оС до плюс 55 оС, и облучение в дозах 1,5-2×106 Р. При таких условиях, когда тепловое и радиационное воздействия не вызывают изменений или эти изменения незначительны, мало влияют на качество и биологическую активность препарата.

В качестве лечебных препаратов использовались высушенные и растертые в порошок ткани и щитовидной железы – источника действующего начала – тиреоидина. Облучение в дозе 2 Мрад не оказывает влияния на свойства такого препарата и стерилизует его, если количество микроорганизмов не превышает 100 м.к. на 1 г препарата [5].

Действие малых доз ионизирующих излучений на скорость обменных процессов и скорость пролиферации приводит к наблюдаемым эффектам в виде увеличения числа и живой массы тела животных.

Вышесказанное явилось основанием для проведения настоящих исследований по разработке способа деконтаминации ростовых сред и стимуляции метаболизма культур клеток с использованием γ-лучей.

Материал и методы исследований.

Работа выполнена в структурном подразделении ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Объектами исследований служили: ростовая среда, среда 199, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), среда Китт-Тароцци, среда Сабуро, MDBK – перевиваемая линия клеток почки эмбриона КРС, полученная S. Madin, N. Darby (1958).

Перевиваемые КК поддерживали общепринятым методом последовательных переносов в соответствии с «Инструкцией по приготовлению питательных сред и культур клеток» [5].

Культуры клеток, выращенные на вышеуказанных средах, подвергали радиостерилизации в дозах 0,05; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7 Гр. Стерильность использованных в опытах объектов определяли путем высева на МПБ, среды Китт-Тароцци, Сабуро. Деконтаминацию искусственно и спонтанно контаминированных ростовых сред проводили на γ-установке «Исследователь» с источником излучения 60 Со в дозах от 1×103 до 2,5×104 Гр.

Учитывая результаты предыдущих радиомикробиологических исследований, свидетельствующих о стимулирующем действии малых доз ионизирующих излучений на рост и развитие микроорганизмов, простейших, клеток и тканей млекопитающих, настоящие исследования проводили по изучению влияния γ-квантов на репродуктивную активность культур клеток.

В работе использовали КК эмбриона почек КРС (MDBK). Для культивирования клеток применяли стандартную полную среду МЕМ, содержащую 10 % сыворотку крови КРС с добавлением пенициллина, стрептомицина по 100000 ЕД/см3.

Выращивание проводили в стандартном СО 2 -инкубаторе при температуре плюс 37 ^оС в атмосфере с 5 %-ным содержанием СО 2 . Пересев клеток проводили каждые 2-3 суток в фазе экспоненциального роста.

Перед началом основных опытов по определению оптимальных доз γ-лучей для деконтаминации питательных сред проводили исследования по изучению радиочувствительности тест-микробов и вирусов в условиях in vitro.

В опытах использовали референтные и вакцинные штаммы микроорганизмов из семейства аспорогенных и спорогенных бактерий, микоплазм, грибов и вирусов, которые разводили на физиологическом растворе в концентрациях 1×105 - 1×108 м.к./см3 (микроорганизмы) и 1-5 lg ТЦД/50 см3 (вирусы). Опыты проводили в суспензионных (водные суспензии микроорганизмов) условиях с белковой защитой (добавление в субстрат 10 % сыворотки крови КРС) и без нее. Тест-штаммы испытуемых микроорганизмов, содержащихся в водных суспензиях и в условиях защиты, подвергали воздействию γ-лучей на установке «Исследователь» в диапазоне доз от 1 до 30 кГр.

Через 1, 2 и 3 ч после радиационного воздействия из каждой пробирки делали посевы на соответствующие питательные среды, которые термостатировали при температуре плюс 37 оС в течение 7 сут., регистрируя наличие или отсутствие роста использованных       микроорганизмов.

Инактивацию вирусов определяли путем титрования на культуре клеток MDBK по общепринятой методике.

Результат исследований. В начале исследований    использовали    среду, состоящую из 0,5 %-ного гидролизата лактальбумина (ГЛА) на растворе Хэнкса 90 % и 10 %-ной сыворотки крови КРС с добавлением          соответствующих антибиотиков.    При    этом    были использованы образцы ГЛА и сывороток, облученных в дозах от 0,1 до 6,0×104 Гр.

Результаты радиомикробиологических исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Радиочувствительность контаминантов питательных сред к γ-лучам в зависимости от их концентрации и наличия белковой защиты в субстрате

Наименование вида и штамма бактерии, вируса	Доза γ-лучей, инактивирующая тест-микроб, содержащийся в водных суспензиях, кГр			Концентрация вирусов, × lg ТЦД/см3
	без белковой защиты в субстрате		при наличии белковой защиты в субстрате
	концентрация микробов в суспензии, × м.к./см3
	1×103	1×108	1×108	1,0	5,0
E.coli «ПЛ-6»	2,5	3,0	3,5	-	-
E.coli «17»	2,7	3,3	4,1	-	-
St.aureus «209»	1,9	2,2	3,3	-	-
M.agalaсtia «7»	1,2	2,0	3,2	-	-
Sacch.serevisiae «A-7», «192»	3,9	4,3	4,7	-	-
B.subtilis «3»	23,0	25,0	30,0	-	-
Вирус ИРТ (ТК-А)	-	-	20,0	4,9	9,5
Вирус ПГ-3 (ТМ-50)	-	-	15,1	5,9	6,9

Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что тест-микробы и вирусы проявляют вариабельную чувствительность к γ-лучам, которая зависит от штамма, концентрации, а также наличия белковой защиты. Анализ данных таблицы показывает, что использованные в опытах микроорганизмы по радиочувствительности образуют следующий убывающий ряд: M. agalactia

«7» γ-лучей – (1,2-2,0) >  St. aureus «209» -(1,9-2,2 кГр) >  E.coli «ПЛ-6» - (2,5-3,0 кГр) >  E.coli «17» - (2,3-3,3 кГр> Sacch. Serevisiae «А 7» и «192» > Вирус ИРТ «ТК-А» (доза – 4,9-9,5 кГр > Вирус ПГ– 3 «ТМ-50» – (5,1-6,9 кГр >  B. subtilis «3» спороцидная доза – (23-25 кГр >. Присутствие белковой защиты в субстрате резко (в 1,1-2,2 раза) усиливает радиорезистентность используемых микроорганизмов, зависит от вида и штамма микроорганизмов.

При радиационном воздействии на микроорганизмы в дозе 2,0×104 Гр последовала частичная гибель контаминанта St. aureus – в посевах из проб облученных сред наблюдался рост тест штаммов. В качестве тест-культуры в опытах использовали клетки почек эмбриона КРС – MDBK, которые выращивали на подвергнутых γ-облучению в вышеуказанных дозах ГЛА с содержанием 10 % сыворотки крови КРС. С каждой комбинацией облученных компонентов проведено по 9-12 опытов. В качестве контроля использовали среду, состоящую из необлученных ГЛА и сыворотки крови КРС.

Результаты изучения пролиферативной активности культуры MDBK представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Пролиферативная активность клеток MDBK, выращенных в облученных

γ–лучами ростовых средах

Доза облучения сывороток и ГЛА, Гр	Посевная концентрация клеток (млн кл./см3)	Максимальное накопление клеток (млн кл./см3)	Время максимального накопления клеток (ч)	Индекс пролиферации
0,1×104	0,4±0,25	1,5±0,01	48	3,88±0,11
0,5х×104	0,4±0,05	1,48±0,05	48	3,81±0,13
1,0×104	0,4±0,03	1,46±0,03	48	3,79±0,13
5,0×104	0,4±0,05	1,43±0,01	48	3,75±0,17
6,0×104	0,4±0,05	1,10±0,05	48	3,11±0,11*
Контроль	0,4±0,05	1,55±0,03	48	3,91±0,13
Примечание –* Р < 0,05

Данные таблицы показывают, что лучевая обработка питательных сред γ-лучами в дозе 0,1-3,0×104 Гр отрицательного влияния на рост и размножение клеток MDBK не оказывала.

При этом индекс пролиферации (ИП) клеток составлял 3,59. На средах, облученных в дозе 0,1×104 Гр, ИП клеток составлял 3,81-0,5×104 Гр; 3,79-1,0×104 Гр; 3,75-3,0×104 Гр и 3,11-6,01×104 Гр, соответственно. ИП клеток, выращенных на облученных в дозах 0,1-3,0×104 Гр средах, незначительно в 1,0; 1,02; 1,03 и 1,04 раза. При этом Р<0,05 уступал контролю, что свидетельствует об отсутствии ростингибирующей способности у облученных в указанных дозах ростовых сред. В отличие от указанных сред облученные в дозе 6,0×104 Гр среды оказывали ингибирующее действие на рост и развитие клеток, снижая их концентрацию в 1,41 раза (Р<0,01), а индекс пролиферации в 1,26 раза (Р<0,05).

Радиодеконтаминация ростовых сред (сыворотка крови КРС, ГЛА) в дозах от 0,1 до 3,0 ×104 Гр не оказывала отрицательного влияния на основные их характеристики – внешний вид, рН, содержание белка, липидов, альбуминов и глобулинов, что нашло подтверждение при выращивании культур клеток MDBK, т.е. накопление клеток и их пролиферативная активность не отличались от контроля.

На следующем этапе изучали кариологическую стабильность двукратно облученных γ-лучами клеток MDBK. Результаты исследований показали, что облучение клеток культуры MDBK в дозах 0,05 Гр приводило к значительному увеличению выживаемости облученных как контактирующих (монослой), так и одиночных (суспензия) клеток.

Однако при радиационном воздействии в дозах от 2 Гр и выше последовало постепенное снижение выживаемости клеток, а при дозах 9-10 Гр наблюдалось значительное (в 1,83 и 2,42 раза) усиление гибели клеток.

Таким образом, малые дозы γ-лучей (0,05-1 Гр) оказывали стимулирующее действие на КК, более высокие дозы (6-10 Гр) усиливали гибель клеточной популяции, а при радиооблучении в диапазоне доз от 1 до 5 Гр существенного увеличения гибели клеток не наблюдалось.

Установлено, что при обработке КК гамма-лучами в монослое в диапазоне доз от 0,05 до 1 Гр, наблюдалось увеличение выживаемость облученных клеток в 1,02 раза по сравнению с контролем. Начиная с дозы облучения 6 Гр, последовало уменьшение выживаемости клеток в монослое, которое составляло 99 % при дозе 6 Гр; 91 % при 7 Гр; 77,3 % при 8 Гр; 61,5 % при 9 Гр и 53,1 % при 10 Гр по сравнению с контролем.

Учитывая, что повторное воздействие на культивируемые клетки (лимфоциты) вначале малыми (0,1 Гр), а затем большими дозами (5 Гр) приводит не только к существенному увеличению выживаемости облученных клеток, но и стимуляции их репродуктивной способности [6], проводили следующую серию опытов по изучению возможности стимулирующего действия γ-лучей на культуру клеток MDBK при повторном облучении малыми дозами.

Одиночные и контактирующие клетки, выращенные на среде МЕМ с 10 %-ной сывороткой крови КРС с добавлением вышеуказанных антибиотиков по 100 ЕД/см3, подвергали двукратному облучению по схеме: вначале в дозе 0,05 Гр, затем через 3 минуты в дозе 5,95 Гр (общая доза – 6 Гр). Результаты экспериментов показали, что повторное радиационное воздействие на клетки в малой дозе (0,05 Гр) оказывает адаптирующий эффект, который приводит к развитию радиорезистентности к повторному облучению в более высоких дозах (5,95-6 Гр) с повышением их выживаемости. Полученные данные свидетельствуют о том, что предварительное облучение культуры клеток MDBK в малой дозе индуцирует развитие благоприятной адаптивной реакции на ионизирующую радиацию в высоких (в 119 раз превышающих малую) дозах. Учитывая, что повышение выживаемости под воздействием малых доз облучения могло найти отражение и на репродуктивной способности клеток в популяции, проводили следующую серию опытов по изучению влияния двукратного облучения на динамику их роста на фоне двукратного облучения. При этом в качестве критериев оценки стимулирующего действия малых доз γ-лучей использовали концентрацию клеток в процессе культивирования и индекс пролиферации, поскольку эти показатели наряду с урожаем являются определяющими при расчете эффективности масштабирования клеток в биотехнологии. Установлено, что использование метода двукратного последовательного облучения культур MDBK γ-лучами в дозе 0,05 Гр и последующее облучение в дозе 5,95 Гр (летальная доза) оказывало стимулирующее действие на репродукцию клеток, увеличивая концентрацию клеток в 1,77 раза с индексом пролиферации 3,2 по сравнению с контролем.

Заключение. Таким образом, в результате проведенных радиомикробиологических и биотехнологических исследований разработан способ деконтаминации питательных сред, контаминированных вегетативной и спорогенной микрофлорой путем облучения их гамма-лучами в дозах от 1,2 до 3,3 Гр (вегетативной формы микроорганизмов), от 4,9 до 9,5 Гр (вирусы) и от 23 до 25 кГр (спорогенные бациллы). Результаты радиобиологических исследований показали, что двукратное облучение клеток культур MDBK в малых (первое воздействие) и высоких (повторное) дозах предотвращало развитие мутагенного эффекта γ-лучей.

Резюме

Установлено, что облучение ростовых сред в дозах 0,05 Гр и 5-10 Гр оказывает ростостимулирующий эффект, увеличивая численность клеточной популяции в 1,5-2 раза. Однако такие исследования единичны и малоинформативны, что диктует необходимость усовершенствования методов деконтаминации ростовых сред и стимуляции роста культур клеток, обеспечивающих максимальную вируспродуцирующую активность. Целью представленной работы является подбор оптимальных доз γ-лучей для деконтаминации ростовых сред и стимуляцию метаболизма культур клеток.