Способ получения культуры аутологичных клеток из стромы лимфатических узлов у больных вторичной лимфедемой нижних конечностей

Лечение хронических лимфатических отеков нижних конечностей человека представляет собой чрезвычайно трудную задачу. Используемые в настоящее время методы консервативного и оперативного лечения этой патологии приносят таким пациентам лишь временное облегчение [1, 2, 3].

Нами предложен новый радикальный способ коррекции вторичной лимфедемы с помощью клеточных биотехнологий (патент РФ на изобретение № 2280461, зарегистрирован 17.07.06). Эффективность его обоснована в эксперименте на животных [4].

Целью настоящего исследования явилась разработка способа получения культуры клеток из стромы лимфатических узлов человека у больных вторичной лимфедемой нижних конечностей для последующей аутологичной трансплантации.

В соответствии с целью данной работы были поставлены следующие задачи:

• 1.    провести патоморфологическое исследование регионарных (паховых) лимфатических узлов у пациентов с хроническими лимфатическими отеками нижних конечностей;

• 2.    с помощью топографо-анатомического и гистологического анализов установить наиболее подходящие источники лимфоидной ткани для

• 3.    отработать методику выделения и выращивания в культуре клеток из стромы лимфатических узлов человека.

получения стромальных клеток;

Объектом исследования стали паховые и шейные лимфатические узлы человека. Биопсийный материал забирали стерильно у больных, возраст которых составлял 54 – 65 лет, во время операции каротидной эндартериоэктомии при стенозе сонных артерий, либо во время выполнении коррекции лимфооттока на нижних конечностях при хронической лимфедеме. От всех пациентов (n=24) получили в письменной форме добровольное информированное согласие на данное вмешательство и использование полученных результатов в научных публикациях. Для сравнительного анализа использовали секционный материал. Изучены паховые и шейные лимфатические узлы 18 кадаверов (той же возрастной группы) без признаков хронического лимфатического отека нижних конечностей.

Работа выполнена на макро- и микроскопическом уровне. Фиксированные в формалине лимфатические узлы после проводки заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону, проводили морфометрию. Выполняли цитологические исследования мазков-отпечатков со срезов нативных лимфатических узлов.

Выращенные из стромы лимфатических узлов культуры клеток оценивали на жизнеспособность, пролиферативную активность, проводили окраску монослоя по Романовскому-Гимза, выявляли жировые включения суданом IV, определяли СДГ по Нахласу. С помощью моноклональных антител осуществляли фенотипирование клеточного материала.

При интраоперационном макроскопическом исследовании нами зафиксировано увеличение поперечных размеров паховых лимфатических узлов у пациентов с хроническим отеком нижних конечностей 3-4 степени. Узлы достигали в диаметре 25-40 мм, что значительно больше нормы (14 — 24 мм). Изучение гистологических препаратов свидетельствовало о полном отсутствии в структуре лимфатического узла лимфоидных компонентов. Мозговой слой и паракортикальная зоны не определялись. Имело место тотальное замещение лимфоидной ткани соединительной. Наблюдались поля грубоволокнистой соединительной ткани, разрастание жировой, формирование кист (рис.1.)

При гистологическом изучении кадаверного материала (группа сравнения) установлено, что в паховых лимфатических узлах у людей 60-летнего возраста без лимфедемы четко прослежи-

Рис. 1. Паховый лимфатический узел больной С., 78 лет. История болезни 17635/1591. Диагноз: вторичная лимфедема правой нижней конечности III IV степени. Склероз и расширение синусов в мозговом веществе лимфатического узла. Граница между корковым и мозговым слоями размыта. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 56.

вались все структурные компоненты лимфатического узла. Капсула составляла 6,9-8,6 % от его общей площади, но в ней определялось уменьшение количества клеточных элементов, вплоть до полного их исчезновения; преобладали грубые коллагеновые волокна, в отдельных случаях имел место гиалиноз. Доля лимфоидной ткани была в два раза меньше (31,2-33,9 %) доли соединительной ткани, которая составила 59,7-60,2 %. Количественное уменьшение лимфоидной ткани сопровождалось значительным истончением как коркового, так и мозгового вещества лимфатического узла. Разрастанием на их месте жировой, рыхлой и грубоволокнистой соединительной ткани. В корковом веществе обнаруживались единичные «классические»

лимфоидныее узелки. Паракортикальная зона состояла в основном из лимфоцитов, немногочисленных ретикулярных клеток, иммунобластов, макрофагов и различного числа плазмоцитов, визуализирующихся около узелков. Медуллярная часть состояла из тяжей лимфоцитов, рыхло расположенных в виде колонок. Среди них нередко обнаруживались и плазмоциты. Практически во всех изученных нами препаратах процесс возрастной инволюции начинался с центральной части лимфатического узла, то есть с мозгового слоя. Здесь лимфатические синусы в большей части были расширены, лимфоциты в основном разрежены за счет отека. Соответственно происходило количественное снижение клеточного состава: как истинных клеток лимфоидной ткани (больших и малых лимфоцитов, лимфобластов, плазмоцитов – менее 55 % в цитологическом препарате), так и макрофагов и эндотелиальных клеток (менее 35 %).

Такая морфологическая картина паховых лимфатических узлов на стороне тяжелой лимфологической патологии свидетельствует о полном замещении ретикулярной ткани стромы узла тканью соединительной. Склерозирование лимфоидного органа, как исход хронического воспаления, вызывает блокаду его дренажной функции, нарушение лимфаоттока, развитие и прогрес- является регионарной особенностью строения соматических лимфатических узлов, к которым относятся поверхностные лимфатические узлы: шейные, подмышечные и паховые [6, 7].

Теоретический анализ и собственные морфологические исследования показали, что шейная область является наилучшей для получения исходного материала клеточных культур. Поверхностные шейные лимфатические узлы не являются основными, сохраняют архитектонику до преклонного возраста и при микробиологическом исследовании – стерильны.

Нами изучено состояние 36 шейных лимфатических узлов. Макроскопически шейные лимфатические узлы очень вариабельны в размерах (от 8х13мм до 15х23мм). Гистологически в исследованных шейных узлах определялись следующие основные структуры: капсула и трабекулы, кора и паракортикальная зона, медуллярная часть, лимфатические синусы, кровеносные сосуды. Даже при наличии в них инволюционных изменений в виде липидосклероза в этой группе узлов сохраняется достаточное количество лимфоидной ткани (более 30 %) — источника региональнальных стромальных стволовых клеток в культуре (рис.2).

Для получения таких клеток использовали корковую и медуллярную зоны лимфатического узла, капсулу в процессе получения стромальных сирование лимфедемы. Известно, что в анамнезе у таких пациентов в 78 % наблюдений было рожистое воспаление [5].

Попытки выделения стромальных клеток из таких патологически измененных лимфатических узлов не увенчались успехом. В 70 % случаев происходил проростание материала (эндогенное микробное загрязнение), что косвенно подтверждает этиопатогенез данного заболевания. Естественно, что получить полноценный клеточный материал из узла, в котором отсутствует ретикулярная ткань, невозможно. Поэтому возникла необходимость найти альтернативный источник стромальных клеток в пределах одного организма.

Известно, что сильно развитая корковая часть

Рис. 2. Шейный лимфатический узлел больного Л., 60 лет. Диагноз: Стеноз левой височно-сонной артерии. Склероз капсулы узла, грубые коллагеновые волокна в мозговом веществе, разрежение мозгового вещества. Окраска пикрофуксином по ван Гизону. Ув. 200.

Рис. 3. Фибробластоподобные клетки из стромы лимфатического узла человека, эксперимент «Р». Отсутствие экспрессии CD34 в цитоплазме. Двухэтапный непрямой пероксидазный метод. Ув. 200.

клеток удаляли.

Для клеток, выделенных из стромы периферических лимфатических узлов, характерна их высокая адгезия, прямолинейный рост в моно- слое довольно плотных пластов клеток без образования колоний. Клетки имеют вытянутую форму, центрально расположенное ядро, два и более отростков. По форме они напоминают фибробласты, но являются более крупными: длина клетки 67,5±3,1 мкм, поперечный размер 29±1,9 мкм. Они способны индуцировать образование лимфоидной ткани при трансплантации в паховую область [8].

Иммуногистохимическое исследование выращенных клеток с использованием моноклональных антител показало, что они являются СD34 отрицательными и СD105 положительными (рис. 3,4).

Так как CD34 является специфическим маркером гемопоэтических стволовых клеток, отсутствие экспрессии СD34 и экспрессия CD105 подтверждает принадлежность клеток к стромальным. При окраске cуданом IV

Рис. 4. Фибробластоподобные клетки из стромы лимфатического узла человека, эксперимент «Р». Экспрессия CD105 в цитоплазме. Двухэтапный непрямой пероксидазный метод. Ув. 200.

выявлено, что жировые включения в цитоплазме таких клеток в культуре отсутствуют. Реакция с нитросиним тетразоли-ем по Нахласу показала высокую активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в выращенных ретикулярных клетках: мелкие зерна формазана темнофиолетового цвета густо и диффузно расположены в цитоплазме. Это свидетельствует о высоком уровне аэробного дыхания в выращенных клетках [9].

Получение чистой культуры клеток из стромы лимфатических узлов до 4 пассажа занимает временной интервал до 2 месяцев. За это время может быть выращено 4х106 и более клеток. Это вполне достаточно для однократной трансплантации пациенту

и продолжения наращивания культуры.

Таким образом, нами разработан способ получения культур фибробластоподобных клеток из стромы неизмененного поверхностного лимфатического узла человека. Выращенная культура клеток может быть использована для аутотрансплантации в область интереса у пациентов с периферическими хроническими лимфатическими отеками конечностей с целью их купирования.