Способ ускоренного получения клонов спор из отдельных урединий возбудителя ржавчины подсолнечника с применением цитокининов

Введение. Биотрофный гриб, облигатный паразит Puccinia helianthi Schwein. – возбудитель ржавчины подсолнечника, распространён во всех регионах РФ, где возделывается культура [1]. Болезнь приводит к снижению урожая семян и их мас-личности, а отдельных случаях к гибели растений [1]. В последние 10–15 лет часто поступают сообщения о сильном поражении растений подсолнечника в местах с локально сложившимися, благоприятными для развития гриба условиями внешней среды [1; 2]. По данным ФГБНУ «Рос-сельхозцентр», в 2024 г. распространённость болезни составляла от 0,01 до 100 % на отдельных полях, несмотря на сухую и жаркую погоду в период вегетации подсолнечника [2]. Нарастанию распространённости болезни в последние годы способствует появление вирулентных биотипов возбудителя ржавчины. Нами за период 2020–2024 гг. выявлено 27 новых биотипов патогена [3]. Основным эффективным методом борьбы с паразитом является селекция устойчивых генотипов подсолнечника. В 80-е годы прошлого века был разработан метод искусственного заражения растений в фазе 2–4 пары настоящих листьев водной суспензией урединиоспор в условиях теплицы [4]. В то время определение рас P. helianthi проводили с использованием трёх дифференциаторов устойчивости подсолнечника, созданных в Канаде. Sackston W.E. была подтверждена принадлежность изолятов с юга России к первой расе [5]. В то же время Слюсарь Э.Л. была выявлена третья раса [6], которая изредка встречалась на гибридах иностранной селекции. Для тестирования устойчивости селекционного материала в качестве инокулята использовали урединиоспоры, собранные на поражённых листьях подсолнечника в поле [4]. В дальнейшем распространение новых патотипов возбудителя ржавчины в США и Австралии привело к увеличению количества дифференциаторов устойчивости. Было предложено определять вирулентность собранных изолятов по реакции девяти линий-дифференциаторов с присвоением трёхзначного цифрового кода для обозначения патотипа. Эта система была принята на международном уровне для идентификации возбудителя ржавчины во всех странах мира, возделывающих подсолнечник [7].

При искусственном заражении важное значение имеет выбор инокулята. По нашим наблюдениям известно, что уреди-ниоспоры, собранные с одного растения и даже листа пораженного подсолнечника, представляют собой смесь разных по вирулентности биотипов. В связи с этим в качестве инокулята необходимо использовать клоны спор из отдельных урединий с идентифицированным кодом вирулентности. Получение клонов и идентификация кодов вирулентности – трудоёмкий и длительный по времени процесс, который необходим для селекции устойчивых форм подсолнечника. В ранее опубликованных нами исследованиях был описан способ получения клонов спор из отдельных уре-диний с использованием 14-дневных растений подсолнечника, выращенных в горшках, набитых смесью почвы и песка. Выращивание растений и их заражение осуществляли в камере искусственного климата [8]. За основу были взяты режимы температуры и освещённости, применявшиеся Слюсарь Э.Л. [4].

Исследования направлены на ускорение и упрощение способа получения клонов спор из отдельных урединий для использования их в качестве инокулята в селекции устойчивых форм подсолнечника.

Цель нашей работы: разработать способ ускоренного получения клонов спор из отдельных урединий Puccinia helianthi Schwein. в лабораторных условиях с применением новых материалов и химических соединений без использования почвенно-песчаной смеси.

Материалы и методы. Исследования проводились в лаборатории иммунитета ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК. Для поддержания жизнеспособности фрагментов листьев подсолнечника использовали: абсцизовую кислоту (АБК); цитокининовую пасту; удобрения для подкормки: концентрат Bona Forte; Флора лайф; КРИСТАФЛОР®; восковую эмульсию Пуршат-В; бензоат натрия; бензимидазол; воду водопроводную без хлора. В качестве субстрата испытывали растворы перечисленных препаратов, фильтровальную бумагу, песок и минеральную вату.

Известно, что вместо молодых растений для заражения можно использовать нарезанные фрагменты листьев - метод, к которому особенно часто прибегают при работе с возбудителями ржавчины, ложной мучнистой, а иногда и настоящей мучнистой росы [8]. Для точной оценки важно, чтобы фрагменты листьев хорошо сохранялись до появления симптомов поражения, в чем и заключается причина ограниченности применения методов такого типа.

В практике биотехнологии, сельского хозяйства, медицине и косметологии широко применяются природные гормоны растений - цитокинины или их синтетические аналоги. Цитокинины называют гормонами «омоложения» растительных тканей. Обработка ими растений предотвращает распад хлорофилла и деградацию внутриклеточных структур у изолированных листьев и их фрагментов [9; 10].

Результативность применения этих веществ в значительной мере зависит от окружающей среды, например, от света и температуры, поэтому они пригодны лишь тогда, когда факторы среды можно точно регулировать и постоянно поддерживать (в фитотроне или в климатической камере) [11].

Абсцизовая кислота - гормон, ответственный за торможение ростовых процессов растений в стрессовых ситуациях, обусловленных биотическими и абиотическими факторами. Известно, что некоторые грибы-паразиты вырабатывают АБК для регуляции ростовых процессов хозяина. В патосистемах с биотрофными патогенами её активность может быть разнонаправленной [9]. Установлено, что активность ее зависит от концентрации и времени применения в отношении одного и того же био-трофного патогена [11]. Известно, что АБК ингибировала развитие бурой и желтой ржавчины пшеницы [11; 12; 13].

Синтетические соединения, содержащие имидазольное кольцо адениновых цитокининов: бензимидазол, 4-бензиламино-бензимидазол и 4-фурфуриламинобензи-мидазол проявляют цитокининоподобную активность при концентрациях 20–40 мкМ в отношении роста каллуса табака и степени сохранения в листьях хлорофилла [14]. Культивирование возбудителей на срезанных листьях, плавающих на растворах цитокининов, используется для определения рас возбудителей ржавчины, мучнистой росы и других облигатных паразитов. Известно, что для культивирования желтой ржавчины на срезанных листьях пшеницы применяли слабый раствор бензимидазола [15]. Он оказывал цитокинетическое влияние, которое позволяло культивировать в течение месяца срезанные листья пшеницы, плавающие на его поверхности [16]. Типы заражения, свойственные различным расам возбудителей листовой и желтой ржавчины на культуре срезанных листьев, были подобны типам инфекции, вызываемым при заражении листьев проростков пшеницы [15].

В последние годы разработаны и широко используются комплексные препараты Пуршат-В, концентрат Bona Forte, Флора лайф, Кристафлор® для поддержания срезанных цветов в свежем состоянии. Они в основном содержат микроудобрения и стимуляторы, их полный состав не публикуется.

Бензоат натрия применяется как консервант, оказывая сильное угнетающее действие на дрожжи и плесневые грибы, включая афлатоксинообразующие, подавляет в клетках активность ферментов, расщепляющих жиры и крахмал, а также ответственных за окислительно-восстановительные реакции. Он сдерживает развитие бактерий и широко используется как пищевая добавка [17].

Клоны спор из отдельных урединий культивировали на отсечённых листьях подсолнечника и их фрагментах. Для этих целей выращивали растения подсолнечника сорта ВНИИМК 8883 улучшенный до фазы 2-й пары настоящих листьев.

Для заражения каждого объекта использовали споры из отдельных урединий, которые наносили стерильным стеклянным шпателем.

В эксперименте с выращиванием клонов урединиоспор на плавающих фрагментах листьев подсолнечника использовали воду и растворы абсцизовой кислоты (АБК) маточного раствора 0,004 мг АБК на 161 мл Н 2 О и его разведений: 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4,5, 9, 13,5 мкМ (микромоль) на 100 мл Н 2 О, Пуршата-В, цитокининовой пасты, концентрата Bona Forte, Флора лайф, Кри-стафлор®, бензоата натрия в рекомендованных инструкцией концентрациях, бензимидазола (60 мг на 1 литр воды).

В стеклянные чашки Петри без крышек диаметром 10,5 мм наливали по 50 мл воды или растворов абсцизовой кислоты (АБК), Пуршата-В, цитокининовой пасты, концентрата Bona Forte, Флора лайф, Кри-стафлор®, бензоата натрия, бензимидазола и раскладывали пинцетом предварительно заражённые листья подсолнечника и их фрагменты, накрывали полиэтиленовой плёнкой для создания влажной камеры и оставляли на сутки в камере искусственного климата при температуре 18–20 ℃. Далее культивировали при температуре 25–27 ℃ и 16-часовом фотопериоде. Симптомы поражения изучали на 10-е сутки. Подсчитывали количество сформированных урединий на каждом листе и фрагменте.

В варианте с применением субстрата, пропитанного жидкостью, испытывали минеральную вату, используемую в растениеводстве.

В качестве субстрата для выращивания растений подсолнечника в камерах искусственного климата и лабораторных условиях обычно используют смесь почвы с песком, что является достаточно трудоёмким процессом. Кроме того, в почве часто присутствует патогенная микрофлора, которая может вызывать поражение экспериментальных растений. Возникла необходимость в разработке новых методов для получения чистых клонов урединио- спор возбудителя ржавчины подсолнечника. Известно об использовании гидропоники для выращивания растений культур разного назначения [18]. Лидирующим субстратом в гидропонной отрасли, на котором выращиваются и цветы, и овощи, является минеральная вата (агровата, каменная вата).

Минеральная вата – это легкий субстрат с максимальной объемной плотностью (0,1 г/ см3) и высокой пористостью (до 98 %). Это смесь трех минералов: базальта, известняка и кокоса, сплавленных при температуре 1600 ℃. Кокос при этом играет роль топлива. В расплавленном состоянии из смеси формируются волокна, совокупности которых далее придаётся форма плит или кубиков различного размера [19].

Минеральную вату помещали на дно пластиковых растилен, покрывали фильтровальной бумагой, пропитывали водой или вышеперечисленными растворами. Далее опыт проводили по приведённому выше описанию.

Результаты и обсуждение. В селекции подсолнечника на устойчивость к ржавчине в качестве инокулята для искусственного заражения должны использоваться споры доминирующего в посевах биотипа возбудителя. Для этого коллектив лаборатории иммунитета проводит ежегодную идентификацию кодов вирулентности биотипов возбудителя ржавчины с изоля-тов, собранных в разных регионах РФ. Выявлено большое разнообразие биотипов возбудителя ржавчины подсолнечника, различающихся кодом вирулентности. В выборках изолятов возбудителя из разных регионов РФ чаще преобладал биотип с вирулентным кодом 700. В данной работе в экспериментах использовали биотип с кодовым номером 700.

Первым этапом исследований было испытание препаратов для поддержания жизнеспособности отсечённых листьев подсолнечника и их фрагментов с последующей инокуляцией урединиоспорами. Для этого применяли водные растворы вышеперечисленных препаратов.

Было обнаружено, что использование в качестве субстрата одних только жидкостей затруднено тем, что при перемещении емкости с плавающими фрагментами листьев происходило их погружение в раствор, что сказывалось на состоянии патогена и затрудняло сбор образовавшихся урединиоспор.

В качестве твердых субстратов испытывали фильтровальную бумагу, песок и минеральную вату. Последняя оказалась наиболее пригодной из-за высокой пористости и способности удерживать воду. Фильтровальная бумага быстро пересыхала, и это являлось основным ее недостатком. Трудоемкость подготовки песка: заготовка и стерилизация, делает его менее привлекательным для использования в качестве субстрата. Растворами указанных выше препаратов пропитывали минеральную вату, помещенную в растильни и накрытую фильтровальной бумагой.

Средняя продолжительность периода жизнеспособности инокулированных фрагментов листьев учитывалась по количеству суток нахождения их в зеленом состоянии и зависела от примененного препарата (табл. 1).

Таблица 1 Состояние отсеченных листьев подсолнечника и их фрагментов на минеральной вате в зависимости от примененных химических препаратов

Препарат, концентрация	Средняя продолжительность периода жизнеспособности, сут.
	зеленый	пожелтение	некроз
*Абсцизовая кислота, 4,5 мкМ	12	16	16
Пуршат-В	1	1	1
Цитокининовая паста	1	1	2
Концентрат Bona Forte	1	2	2
Флора лайф	1	2	3
Кристафлор®	2	2	2
Бензоат натрия	2	3	4
Бензимидазол	20	30	30
Вода	9	9	12

*Экспериментально установленная концентрация

Непригодными для поддержания жизнеспособности листьев подсолнечника оказа- лись препараты для срезанных цветов (Пур-шат-В, концентрат Bona Forte; Флора лайф; Кристафлор®), а также бензоат натрия и цитокининовая паста. В присутствии препаратов листья и их фрагменты оставались в зелёном состоянии от 1 до 3 суток, в дальнейшем они желтели и усыхали.

Эксперимент с абсцизовой кислотой подтвердил известный факт разнонаправленной активности её растворов в патогенезе Erysiphe graminis. Одни концентрации вызывали ингибирование, а другие – стимулирование роста патогена [11]. Мы наблюдали такое явление в патосистеме P. helianthi с подсолнечником при размещении инокулированных фрагментов листьев подсолнечника на растворах АБК. Число сформированных урединий в вариантах с концентрацией 0,25, 0,5 и 2 мкМ равнялось 1 шт., тогда как в контрольном варианте с водой – 4 шт. на фрагмент листа, что указывает на ингибирующее действие этих концентраций. Наибольшее количество урединий сформировалось в варианте с концентрацией АБК 4,5 мкМ и составило 24 на фрагмент листа. При концентрации 9 мкМ среднее количество урединий приблизилось к показателям контрольного варианта с водой и было равно 3 шт. При концентрации 13,5 мкМ их количество составило 14 шт. на фрагмент (табл. 2).

Таблица 2 Среднее количество урединий, образовавшихся на фрагментах листьев подсолнечника в зависимости от концентрации абсцизовой кислоты при заражении клоном урединиоспор биотипа 700

Среднее количество урединий, шт.
Вода (контроль)	Концентрация раствора абсцизовой кислоты, мкМ
	0,25	0,5	1,0	2,0	3,0	4,5	9,0	13,5
4	1	1	3	1	2	24	3	14

Стимулирующий эффект действия АБК на формирование урединий можно использовать для увеличения количества уреди-ниоспор монопустульных клонов, культивируя их на отсечённых листьях, помещённых на минеральную вату, пропитанную раствором АБК с концентрацией 4,5 мл маточного раствора на 100 мл воды (рис. 1).

а

б

Рисунок 1 – Листья подсолнечника на минеральной вате, пропитанной раствором АБК концентрации маточного раствора

4,5 мл на 100 мл воды и покрытой фильтровальной бумагой:

а) заражённые спорами из отдельных урединий;

б) с клонами урединиоспор возбудителя ржавчины (ориг.)

Использование раствора АБК для поддержания листьев и их фрагментов в зелёном состоянии на время инкубационного периода развития болезни возможно для быстрого получения спор из отдельных урединий.

Из испытанных препаратов наиболее приемлемым был бензимидазол, на пропитанной раствором концентрацией 60 мг на 1 литр воды листья подсолнечника и их фрагменты сохранялись в зеленом состоянии до 20 суток в регулируемых температурном и световом режимах. На 10-е сутки культивирования на них формировались урединии (рис. 2).

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан лабораторный способ ускоренного получения клонов спор из отдельных урединий любого биотипа возбудителя ржавчины. Для сохранения отсечённых листьев и их фрагментов в зелёном состоянии на время инкубационного периода возбудителя ржавчины после заражения спорами из отдельных урединий необходимо использовать бензимидазол в контролируемых условиях выращивания.

Рисунок 2 – Урединии возбудителя ржавчины, сформированные на фрагментах листьев подсолнечника на растворе бензимидазола на 10-е сутки из отдельных спор клонового происхождения (ориг.)

Заключение. Таким образом, разработан лабораторный способ ускоренного получения клонов спор из отдельных уреди-ний на фрагментах отсеченных листьев подсолнечника, помещенных в растильни с субстратом в виде минеральной ваты, пропитанной раствором абсцизовой кислоты в концентрации 4,5 мкМ маточного раствора на 100 мл воды и бензимидазола 60 мг на 1 л воды. Они не только сохраняют длительную жизнеспособность фрагментов листьев подсолнечника, достаточную для развития на них возбудителя ржавчины и формирования новых урединий с клонами спор, но и способствуют увеличению количества образующихся урединий.