Способность ооцитов коров к эмбриональному развитию при созревании в разных системах двухфазного культивирования

Использование экстракорпорального оплодотворения в сочетании с технологией трансплантации эмбрионов рассматривается как один из надежных и эффективных способов разведения высокопродуктивных и ценных особей, а также сохранения генетического потенциала редких и исчезающих пород (1). Разработанные к настоящему времени протоколы культивирования и оплодотворения in vitro ооцитов домашней коровы (Bos taurus taurus) позволяют получить достаточно высокий выход морул и бластоцист, однако потенциал к эмбриональному развитию у созревших вне организма яйцеклеток по-прежнему остается значительно более низ- ким, чем у яйцеклеток, созревших in vivo (2).

В организме животных развитие ооцитов происходит в фолликулах яичников, где они естественным образом и последовательно приобретают способность к ядерному созреванию от стадии диплотены до стадии метафазы II. Процессу ядерного созревания ооцитов сопутствует комплекс цитоплазматических преобразований, охватывающих изменения в организации индивидуальных органелл и молекулярные трансформации, которые необходимы для приобретения яйцеклетками компетенции к оплодотворению и последующему эмбриональному развитию (3). Когда незрелые ооциты выделяют из фолликулов и культивируют in vitro, мейоз в них возобновляется спонтанно и преждевременно, что приводит к неполному цитоплазматическому созреванию и снижению способности к развитию (4). При этом условия окружающей среды в культуре становятся одним из ключевых факторов, определяющих качество зрелых ооцитов (2).

В настоящее время существуют различные подходы к повышению полноценности ооцитов в процессе их созревания in vitro (in vitro maturation , IVM). Наиболее интересными представляются попытки смоделировать события, происходящие в естественных условиях. Один из таких подходов сфокусирован на анализе метаболических процессов в созревающих ооцит-кумулюсных комплексах (ОКК) (5, 6). На основании данных этого анализа предполагается модифицировать среду культивирования в соответствии с энергетическими потребностями ооцитов и их метаболической кооперацией с окружающими соматическими клетками. В работах других исследователей сделаны попытки использовать добавки в среду паракринных факторов, которые продуцируются ооцитами и могут поддерживать определенную степень дифференцировки клеток кумулюса (7, 8).

Поскольку в период созревания in vitro ооцитов млекопитающих существует временная несогласованность (асинхронность) между ядерны-ми и цитоплазматическими преобразованиями, более перспективным выглядит дифференцированный подход, предусматривающий использование двухфазной системы культивирования. Целесообразность применения двухфазного протокола созревания in vitro ооцитов крупного рогатого скота (КРС) активно изучается в последние несколько лет. Ведется поиск оптимальных методов ингибирования спонтанного возобновления мейоза (9, 10). Считается, что торможение мейоза может позволить большему числу ооцитов завершить цитоплазматические преобразования и приобрести компетенцию к развитию. Ооциты, выделенные из фолликулов, некоторое время культивируют в среде созревания с добавлением регуляторов мейо-за, главным образом ингибиторов cdk-киназ, способных блокировать переход от диплотены к метафазе I, а затем — в отсутствие этих веществ. Тем не менее, полученные результаты довольно противоречивы и свидетельствуют о необходимости поиска специфических молекул для стимуляции ооцитов во время блокирования мейоза (11-15).

Следует отметить, что основные цитоплазматические преобразования, от которых в конечном итоге зависит способность ооцитов к эмбриональному развитию, происходят не на начальном, а на завершающем этапе созревания, что свидетельствует о необходимости изучать специфические потребности женских гамет именно в этот период. По данным ряда авторов, при созревании ооцитов коров in vitro, как и in vivo, наблюдается повышение концентрации прогестерона и снижение концентрации эстрогенов в среде культивирования. Наиболее значимые изменения в кинетике этих процессов происходят через 8-10 ч с момента начала IVM, что соответствует периоду от метафазы I до метафазы II (16-18). В то же время во многих общепринятых однофазных системах культивирования ооцитов коров, включающих фолликулостимулирующий (ФСГ) и лютеинизирующий (ЛГ) гормоны или их аналоги, характер изменений соотношения 170-эстрадиола и прогестерона отличается от такового in vivo (19).

Поэтому представляется целесообразным использовать новый подход к двухфазному культивированию. Он основан на созревании яйцеклеток коров до стадии метафазы I в стандартной системе и последующем переносе в новую среду, модифицированную внесением физиологически уместных веществ, которые оказывают лютеотропное действие, или клеток гранулезы, обладающих большей стероидогенной активностью, чем клетки кумулюса (20).

Нами впервые изучена способность яйцеклеток к развитию до стадии бластоцисты и качество полученных эмбрионов при замене стандартной среды на втором этапе культивирования на среду, свободную от ФСГ (стимулятора синтеза эстрогенов), а также на культуру клеток гранулезы.

Целью представленного исследования было сравнение компетенции к развитию у ооцитов коров, созревших в общепринятой однофазной и различных двухфазных системах.

Методика . Во всех экспериментах, кроме отдельно указанных случаев, были использованы реагенты фирмы «Sigma-Aldrich» (США).

Объектом исследования служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) из антральных фолликулов яичников коров ( Bos taurus taurus ) и половозрелых телок. Яичники, отобранные после убоя, доставляли в лабораторию в течение 3-5 ч при 30-35 ° С и многократно отмывали в стерильном физиологическом растворе с антибиотиками (пенициллин — 100 МЕ/мл, стрептомицин — 50 мкг/мл). ОКК выделяли посредством рассечения лезвием стенок фолликулов и промывали 3 раза в среде ТС-199, содержащей 5 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 10 мкг/мл гепарина, 0,2 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина. Для экспериментов отбирали ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным куму-люсом. Все манипуляции с ооцитами осуществляли под стереомикроскопом SMZ («Nikon», Япония) на нагревательном столике MATS-OZ («Tokai Hit», Япония) при 37 ° С.

ОКК культивировали в 4-луночных планшетах группами по 3035 шт. в 500 мкл среды при температуре 38,5 ° С в атмосфере с 5 % СО 2 и 90 % влажностью. Для получения созревших ооцитов применяли стандартную однофазную (контроль) и двухфазную системы культивирования. При использовании однофазной системы ОКК культивировали в течение 24 ч в среде ТС-199, содержащей 10 % ФБС, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл ФСГ и 10 мкг/мл ЛГ. В двухфазной системе ооциты созревали в тех же условиях в течение первых 12 ч. Затем ОКК пересаживали в новую среду и культивировали в течение последующих 12 ч в присутствии и в отсутствие клеток гранулезы. На втором этапе двухфазного культивирования применяли среду ТС-199, содержащую 10 % ФБС, 1 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина (внутренний контроль) или эту же среду, дополненную ЛГ (5 мкг/мл).

Клетки гранулезы получали посредством аспирации жидкости из фолликулов диаметром 3-5 мм и последующего центрифугирования материала при 250 g в течение 10 мин. После удаления супернатанта клетки дважды отмывали в среде ТС-199, содержащей 5 % ФБС и 50 мкг/мл гентамицина. Конечное число клеток подсчитывали в камере Горяева, долю живых клеток определяли с помощью 0,1 % раствора трипанового синего. 778

Клетки гранулезы (1½106/мл) предварительно культивировали в 4-луночных планшетах в 500 мкл среды ТС-199, содержащей 10 % ФБС, 1 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина. Через 12 ч 250 мкл среды заменяли свежей средой, затем вносили в лунки ОКК. Совместное культивирование ооцитов и клеток гранулезы проводили в течение 12 ч.

В конце культивирования среды собирали, замораживали и хранили при - 20 ° С. Содержание прогестерона и 17 р -эстрадиола в образцах сред определяли методом иммуноферментного анализа. Анализы проводили с использованием планшетного спектрофотометра Униплан («Пикон», Россия) и коммерческих наборов реагентов «НВО Иммунотех» (Россия) и «Хема» (Россия) согласно инструкции фирм-производителей. Чувствительность метода составляла 0,4 нмоль/л для прогестерона и 25 пмоль/л для 17 р -эстрадиола. Все анализы выполняли в 2 повторностях, коэффициент вариации внутри анализов не превышал 13 %.

Ооциты оплодотворяли in vitro, как описано ранее (21). ОКК, созревшие в однофазной или двухфазной системе, промывали однократно в среде Fert-TALP, модифицированной внесением 10 мкг/мл гепарина, 20 мкМ пенициламина, 10 мкМ гипотаурина и 1 мкМ эпинефрина, и переносили в 4-луночные планшеты («Nunc», Дания), которые содержали 400 мкл той же среды, покрытой равным объемом минерального масла. Активные сперматозоиды, полученные методом swim-up (22), добавляли в лунки с созревшими ооцитами в конечной концентрации 1½10⁶ спермато-зоидов/мл. Во всех экспериментах для оплодотворения ооцитов использовали заморожено-оттаянную сперму одного быка. Оплодотворение ооцитов, а также культивирование эмбрионов проводили при температуре 38,5 ° С в атмосфере с 5 % СО₂ и 90 % влажностью.

Через 18-20 ч совместной инкубации со спермой ооциты осторожно пипетировали и отмывали в среде Fert-TALP для освобождения от клеток кумулюса и налипших сперматозоидов. Предполагаемые зиготы переносили в среду CR1aa (23) и культивировали в течение 4 сут, после чего развивающиеся эмбрионы помещали в ту же среду, содержащую 5 % ФБС. На 2-е сут после оплодотворения ооцитов проводили морфологическую оценку раздробившихся зигот, на 7-е сут определяли число эмбрионов, развившихся до стадий поздней морулы и бластоцисты. Оценку выполняли под стереомикроскопом SMZ («Nikon», Япония) при увеличении ½40.

Полученные морулы и бластоцисты фиксировали 4 % раствором параформальдегида в натрий-фосфатном буфере в течение 60 мин при комнатной температуре. После фиксации эмбрионы пермеабилизировали в течение 30 мин в 0,1 % растворе цитрата натрия, содержащем 0,5 % Тритона Х-100. Степень апоптотических изменений ядерного материала в эмбрионах определяли методом TUNEL с использованием набора In Situ Cell Death Detection Kit, fluorescein («Roche Diagnostics», Швейцария) согласно инструкции компании-производителя. Затем эмбрионы окрашивали в течение 20 мин раствором DAPI (1 мкг/мл) с целью локализации ядер, переносили на сухое обезжиренное стекло и заключали в среду Vectashield («Vector Laboratories», Великобритания). Микрофотографирование и оценку препаратов выполняли под моторизованным микроскопом Axio Imager.M2 («Carl Zeiss», Германия), оснащенным флуоресцентной приставкой, с использованием программы ZEN 2 pro («Carl Zeiss», Германия). Степень апоптоза в бластоцистах оценивали по доле TUNEL-позитивных ядер (зеленая окраска) от общего числа ядер (синяя окраска).

Эксперименты по культивированию ооцитов повторяли не менее 6 раз. Полученные данные обрабатывали методом однофакторного (one- way ANOVA) и двухфакторного (two-way ANOVA) дисперсионного анализа при помощи программы SigmaStat («Systat Software, Inc.», США). Результаты представлены в виде средних значений (X) и стандартных ошибок (±SEM). Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали с использованием критерия Тьюки (Tukey's test).

Результаты . Экстракорпоральное созревание ооцитов — важный этап технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, моделированием которого можно существенно повысить ее эффективность (7). В представленной работе наряду со стандартным однофазным протоколом IVM мы впервые использовали двухфазное культивирование ооцитов коров, которое предполагало их созревание в течение первых 12 ч в общепринятой системе, содержащей гонадотропные гормоны, и последующих 12 ч — в новой среде без гормонов. Кроме того, была предпринята попытка модифицировать вторую фазу посредством внесения в систему ЛГ и (или) культивирования ооцитов на монослое клеток гранулезы.

На первом этапе работы мы исследовали количественные и качественные характеристики ооцитов коров при эмбриональном развитии in vitro (табл.). Способность ооцитов вступать в первое деление дробления и развиваться до стадий поздней морулы/бластоцисты (рис. 1, А) не зависела от способа культивирования. Присутствие клеток гранулезы во вторую фазу созревания ооцитов существенно не изменяло исследуемые показатели, однако при добавлении ЛГ в эту систему наблюдалась тенденция (p < 0,1) к снижению выхода эмбрионов на продвинутых стадиях развития по сравнению с полученным в однофазной системе.

Способность ооцитов коров ( Bos taurus taurus ) к эмбриональному развитию в разных системах дозревания in vitro ( Х ±SEM, n = 6-7)

Система (группа)	КГ	Число ооцитов, шт.	Дробление, %	Развившиеся до стадии поздней морулы/бластоцисты
				% от числа	число ядер
				ооцитов эмбрионов	всего, шт. апоптотических, %
Без КГ ОС          -        224         68,1±3,1     19,9±2,2   28,9±2,2    40,4±2,6a         5,4±2,2 ДС (К)      -        217         66,3±3,9     17,5±2,6   27,1±4,1    56,2±5,8b        2,3±0,8 ДС (ЛГ)     -        220         66,1±4,0     16,8±2,6   25,6±3,7    41,3±3,9         5,1±0,8 В присутствии КГ ОС          -        196         67,1±3,9     20,7±2,2    30,6±1,7    42,0±4,0c         6,4±1,3 ДС (К)     +       189         57,6±5,6     16,7±2,3   28,6±1,7    54,9±4,0d         5,1±1,1 ДС (ЛГ)    +       195         58,2±3,1     13,9±2,6   23,8±4,0    42,4±6,9         6,9±2,7

П р и м еч а ни е. ОС — однофазная система (группа сравнения), ДС (К) — двухфазная система, без лютеинизирующего гормона (контроль), ДС (ЛГ) — двухфазная система с добавлением лютеинизирующего гормона (5 мкг/мл); КГ — клетки гранулезы.

a, b p < 0,05, c, d p < 0,05 — достоверность различий между сравниваемыми группами.

А                        Б                        В

Рис. 1. Репрезентативные микрофотографии эмбрионов коров ( Bos taurus taurus ) на 7-е сут культивирования in vitro и выявление апоптоза: А — морфология морул и бластоцист (увеличение ½100), Б — окраска ядер в бластоцисте с помощью DAPI (синий цвет), цитологический препарат (увеличение ½200), В — окраска апоптотических ядер в бластоцисте методом TUNEL (зеленый цвет), цитологический препарат (TUNEL-позитивные ядра отмечены белыми стрелками, увеличение ½200); микроскоп Axio Imager. M2, «Carl Zeiss», Германия.

Качество эмбрионов, которое оценивали по числу ядер, содержащихся в поздних морулах/бластоцистах на 7-е сут после оплодотворения (см. рис. 1, Б), было выше при двухфазном культивировании в контрольной группе. Перенос ооцитов через 12 ч созревания в среду, лишенную гонадотропных гормонов, приводил к увеличению числа ядер в 1,3-1,4 раза (p < 0,05) и в отсутствие, и в присутствии клеток гранулезы, тогда как при добавлении ЛГ это число снижалось до значений в однофазном контроле (группа сравнения). В то же время доля апоптотических ядер в поздних морулах/бластоцистах (см. рис. 1, В) не зависела от системы дозревания ооцитов или воздействия ЛГ.

Как известно, переход к двухфазной системе культивирования ооцитов свиней, предполагающей исключение гонадотропных гормонов во второй фазе дозревания, кардинальным образом изменил эффективность всей технологии получения эмбрионов in vitro у этого вида животных (24). Данные нашей работы в определенной степени сходны с результатами, наблюдаемыми при созревании ооцитов свиней. Отсутствие ФСГ и ЛГ в среде на втором этапе культивирования ооцитов коров оказывало положительное влияние на развитие поздних морул/бластоцист.

Учитывая важное значение стероидных гормонов для ядерного и цитоплазматического созревания ооцитов КРС (25), на следующем этапе работы мы определяли концентрации 17 β -эстрадиола и прогестерона в культуральных средах, кондиционированных созревающими ОКК, в зависимости от используемой системы культивирования. В конце культивирования содержание 17 β -эстрадиола в двухфазной системе без гормонов (448±25 пг/мл) было меньше, чем в однофазной системе (583±27 пг/мл), в 1,3 раза (p < 0,01) (рис. 2, А). Внесение ЛГ в двухфазную систему обусловило более значительное снижение этого показателя (до 418±16 пг/мл, p < 0,001). Напротив, совместное культивирование ОКК с клетками гранулезы приводило к повышению концентрации 17 β -эстрадиола в культуральной среде, особенно в присутствии ЛГ (до 496±26 пг/мл, p < 0,05). В то же время мы не обнаружили различий между всеми исследуемыми вариантами по содержанию прогестерона в среде культивирования ОКК (см. рис. 2, Б).

Рис. 2. Содержание 17 β -эстрадиола (А) и прогестерона (Б) в культуральной среде после дозревания ооцитов коров ( Bos taurus taurus ) in vitro в разных системах: ОС — однофазная система (группа сравнения), ДС (К) — двухфазная система, без лютеинизирующего гормона (контроль), ДС (ЛГ) — двухфазная система с добавлением лютеинизирующего гормона (5 мкг/мл); 1 — ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК), 2 — ооцит-кумулюсные комплексы + клетки гранулезы (ОКК + КГ). Вертикальные отрезки — стандартные ошибки средних (SEM). Число независимых экспериментов — n = 6 (однофазная система), n = 5 (двухфазная система). ^{a, b} p < 0,01, ^{a, c} p < 0,001, ^{a, d} p < 0,05 — достоверность различий между сравниваемыми группами;

* p < 0,05 — достоверность различий между вариантами ОКК и ОКК + КГ.

Наблюдаемые вариации в содержании 17β-эстрадиола в среде при постоянстве продукции прогестерона фолликулярными клетками во вторую фазу созревания ооцитов не оказывали существенного влияния на способность последних к развитию до стадии поздней морулы/бластоцис-ты. При созревании ооцитов в контрольной двухфазной системе качество эмбрионов на предымплантационной стадии развития могло быть связано с уменьшением содержания 17β-эстрадиола в культуральной среде до определенного уровня, поскольку число ядер в них снижалось как при дальнейшем понижении, так и при повышении концентрации 17β-эстрадиола в присутствии лютеинизирующего гормона.

Таким образом, двухфазная система дозревания ооцитов коров может применяться как альтернатива общепринятому протоколу IVM (in vitro maturation). Перенос ооцитов через 12 ч культивирования в стандартной среде в свежую среду без гонадотропных гормонов не ухудшает их способность к дальнейшему эмбриональному развитию и повышает качество полученных поздних морул/бластоцист. Кроме того, концентрация 17 β -эстрадиола в культуральной среде на завершающем этапе дозревания ооцитов снижается, что также может оказывать некоторое положительное влияние на яйцеклетки. Отсутствие повышения содержания прогестерона в среде при изученных условиях указывает на необходимость поиска физиологически уместных факторов, стимулирующих продукцию прогестерона в ооцит-кумулюсных комплексах, с целью их дальнейшего применения во вторую фазу культивирования яйцеклеток.