Способность продуцировать охратоксин а и цитринин у Penicillium verrucosum и P. viridicatum из зерна и травяных кормов, отобранных в разных регионах России

В последние десятилетия достигнут значительный прогресс в изучении распространенности видов Penicillium подрода Penicillium в объектах окружающей среды и способности таких видов продуцировать широкий спектр метаболитов с токсическим действием (1-3). В ряде европейских стран для одного из них — P. verrucosum Dierckx показана преимущественная распространенность на злаках и прямая связь между пораженностью зерна и частотой обнаружения их метаболитов с нефропатическим действием (4-6). Однако доступные сведения о характере токсинообразования у изолятов этого гриба, выделенных из зерна и кормовых объектов, остаются весьма ограниченными. Так, в Испании у 11 изолятов P. verrucosum из злаков и кормов обнаружен охратоксин А (ОА) в количествах от 0,02 до 213 мкг/г и у 10 подтверждено образование цитринина (ЦИТ) (7). При обследовании кормов в Индии для 22 штаммов из 30 показана способность продуцировать ОА и ЦИТ, однако какие-либо пояснения относительно их количества, раздельного или совместного обнаружения отсутствуют (8).

Многие годы совокупность культурально-морфологических признаков, введенных для описания таксона P. viridicatum Westling (9), служила основой для поиска этого микромицета в объектах окружающей среды (10, 11) и изучения его токсинообразования (12, 13). Однако позднее было предложено несколько подходов для выделения групп в пределах вида по фенотипическим, биосинтетическим и экологическим критериям (14-16).

В России токсигенному потенциалу микроскопических грибов, поражающих корма, посвящена серия недавних публикаций, в том числе по 11 видам Penicillium (17, 18). По данным российских исследователей, культурально-морфологические признаки, ранее принятые для P. viridicatum Westling (9), оказались характерными для изолятов, которые в зерне пшеницы, ячменя, овса, ржи встречаются с частотой 20 % (19), в сухих травяных кормах (сено, солома) — с частотой 1,3 % (20).

В настоящей работе нами впервые установлено, что в этой группе изолятов представлены в основном вид P. verrucosum и реже P. viridicatum, дана оценка особенностей их токсинообразования in vitro и показано, что P. verrucosum может иметь отношение к контаминации зерновых и травяных кормов нефротоксинами.

Целью исследования стала оценка токсигенности культур P. viridica-tum Westling (9), выделенных из зерна и травяных кормов, описание их макро- и микроморфологических свойств и сравнение идентифицированных видов по способности продуцировать охратоксин А и цитринин.

Методика. Изучали 33 изолята, предварительно идентифицированные по определителю (9) как P. viridicatum Westling, из исследовательской коллекции лаборатории микотоксикологии и санитарии кормов (ВНИИВСГЭ — филиал ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН). Из зерна грибы выделяли после его поверхностной дезинфекции, из шрота подсолнечного и гороха — после измельчения и приготовления взвесей посредством последовательных 10-кратных разведений в 0,1 % водном растворе Tween 80, из силоса и сена — прямым посевом мелких измельченных фрагментов; чистые культуры хранили в пробирках на агаре Чапека-Докса (ЧДА) при температуре 5 ° С.

Микроморфологические характеристики (строение кисточки, размеры конидиеносцев, ветвей, метул, фиалид и конидий) определяли для изолятов, выращенных на ЧДА (9), с помощью микроскопа (Eclipse E200, «Nikon», Япония) при 400-кратном увеличении. Макроморфологические свойства грибов изучали в соответствии с описанием (21). Культуры выращивали в течение 7 сут на следующих средах: YES (сахарозный агар с дрожжевым экстрактом: дрожжевой экстракт 20 г, сахароза 150 г, магний сернокислый 7-водный 0,5 г, медь сернокислая 5-водная 0,005 г, цинк сернокислый 7-водный 0,01 г, агар 20 г, дистиллированная вода 1000 мл), 25 ° С; CREA (сахарозный агар с креатином: моногидрат креатина 3 г, сахароза 30 г, калий фосфорнокислый двузамещенный 7-водный 1,6 г, магний сернокислый 7-водный 0,5 г, калий хлористый 0,5 г, железо сернокислое(II) 7-вод-ное 0,01 г, медь сернокислая 5-водная 0,005 г, цинк сернокислый 7-водный

0,01 г, бромкрезоловый пурпурный 0,05 г, агар 20 г, дистиллированная вода 1000 мл), 25 ° С; CYA (агар Чапека с экстрактом автолизата дрожжей: натрий азотнокислый 3 г, экстракт автолизата дрожжей 5 г, сахароза 30 г, калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 1,3 г, магний сернокислый 7-водный 0,5 г, калий хлористый 0,5 г, железо сернокислое(II) 7-водное 0,01 г, медь сернокислая 5-водная 0,005 г, цинк сернокислый 7-вод-ный 0,01 г, агар 15 г, дистиллированная вода 1000 мл), 25 ° С, 30 ° С. Подкисление среды CREA при культивировании изолятов определяли по изменению ее цвета (21).

Для оценки токсинообразования культур в качестве субстрата использовали шлифованный круглозерный рис. Дополнительно для одного из штаммов (¹ 74/2) — овсяные хлопья, пшеницу, ячмень, овес, просо и кукурузу (в виде круп). Инокулюм готовили, выращивая изоляты на скошенном агаре Чапека-Докса в течение 7-10 сут при температуре 23-25 ° С. С помощью микологического крючка инокулюм переносили в стеклянные флаконы объемом 10 мл с диаметром дна 18 мм, содержащие по 1 г зернового субстрата, который перед автоклавированием увлажняли 1 мл воды. Каждый вариант опыта выполняли в трех повторностях. После посева флаконы, закрытые ватно-марлевыми пробками и слоем пленки (Parafilm M^® PM-996, «Pechiney Plastic Packing», США), выдерживали в темноте при 25 ° С в течение 7 сут. Затем в каждый добавляли по 3 мл смеси ацетонитрила и воды в объемном соотношении 84:16 и интенсивно встряхивали в начале и конце 14-часовой стационарной инкубации. После разведения экстрактов фосфатно-солевым буферным раствором рН 7,4 с Tween 20 концентрации ОА и ЦИТ определяли методом непрямого конкурентного иммунофермент-ного анализа с помощью аттестованных коммерческих тест-систем в соответствии с рекомендациями производителя (ВНИИВСГЭ, Россия). Пределы определения ОА и ЦИТ составили соответственно 0,08 нг/мл и 0,4 нг/мл. Измерения выполняли на планшетном фотометре (Stat Fax-2100, «AWA-RENESS Technology, Inc.», США, госреестр ¹ 47063-11).

Результаты выражали как средние арифметические значения ( М ) и стандартные ошибки средних (±SEM).

Результаты. Образцы зерна и травяных кормов для изучения были отобраны в разные годы (табл. 1):

1. Происхождение изолятов изученной выборки, исходно идентифицированных как Penicillium viridicatum Westling

Исходные изоляты характеризовались общими микроморфологиче- скими признаками. Шероховатые конидиеносцы размером 200½3,4-4,0 мкм были собраны в коремии. Имелись шаровидные и полушаровидные конидии (3,0-3,5 мкм) с гладкими или немного шероховатыми стенками, несимметрично ветвящиеся кисточки из нескольких неприжатых ветвей (10-20½2,8-3,5 мкм) с метулами цилиндрической формы размером 9-15½2,5-3,3 мкм по 2-4 в пучке, фиалиды размером 7-9½2,5-3,5 мкм по 3-5 в пучке. Более выраженную шероховатость конидиеносцев отмечали у восьми из изученных изолятов. У этих изолятов диаметр колоний на среде YES составил 25-40 мм (обратная сторона желтого цвета), на CREA — 17-24 мм, на CYA — 19-35 мм при 25 °С и 6-18 мм при 30 °С; при культивировании на CREA происходило подкисление среды с изменением ее цвета. Полученные данные позволили идентифицировать эти штаммы как P. viridicatum Westling (серия Viridicata). Два из них были выделены из образца гороха (¹¹ 46/7, 46/8), один — из зерна ячменя (¹ 56/3) и пять — из зерна пшеницы (¹¹ 254/6-1, 254/6-2, 254/10, 254/13-1, 254/13-2). Остальные 25 штаммов характеризовались меньшей скоростью роста, не подкисляли среду CREA, по размеру и цвету колоний соответствовали виду P. verrucosum Dierckx (серия Verrucosa): диаметр колоний на среде YES составлял 20-32 мм (обратная сторона терракотового цвета), на CREA — 12-15 мм, на CYA при 25 °С — 15-24 мм (обратная сторона кремово-желтая, часто с коричневым центром), при 30 °С рост отсутствовал. Оба вида по совокупности микро- и макроморфологичесиких признаков принадлежали к секции Vi-ridicata (21, 22).

На современном этапе для определения и уточнения таксономического положения грибов используется их культивирование на агаризован-ных и жидких средах с последующим применением для анализа образцов биомассы хроматографических приемов (23, 24). Для оценки продуцирования микотоксинов у изолятов мы использовали зерновой субстрат, который, по нашим данным, обеспечивает наибольшую интенсивность токси-нообразования (17, 18), и количественное определение аналитов методом иммуноферментного анализа (ELISA-тест). Наши результаты полностью соответствуют данным по хемотаксономическим маркерам, описанным для обоих видов (25, 26). Так, в образцах P. viridicatum ОА и ЦИТ детектировать не удалось, тогда как для P. verrucosum получено подтверждение способности к биосинтезу нефротоксинов: все штаммы P. verrucosum продуцировали ЦИТ, а часть из них — ОА (табл. 2).

2 . Продуцирование охратоксина А и цитринина у 25 изолятов Penicillium verru-cosum Dierckx из изученной выборки при росте на зерне риса (7 сут, 25 ° С; M ±SEM)

У 17 штаммов, продуцирующих оба метаболита, накопление ЦИТ в среднем по выборке было примерно в 15 раз выше, чем ОА. Один из продуцентов (¹ 74/2), у которого соотношение ОА/ЦИТ при росте на зерне риса составило 4,2±0,8/50±8 мкг/г (см. табл. 2), в тех же условиях на пяти других видах зерна также преимущественно продуцировал ЦИТ в сравнении с ОА: 2±0,4/37±5 мкг/г на пшенице, 0,9±0,2/21±2 мкг/г на ячмене, 1,7±0,4/38±6 мкг/г на овсе, 0,2±0/10±2 мкг/г на просе и 0,1±0/55±8 мкг/г на кукурузе. Сходное соотношение количеств ОА/ЦИТ ранее было определено для коллекционного штамма P. verrucosum KKP 480 при длительном культивировании (40 сут, 20 ° С) на рисе (30/75 мкг/г), пшенице (15/60 мкг/г), ячмене (10/30 мкг/г), тритикале (8/10 мкг/г) и кукурузе (5/8 мкг/г) (27). По-видимому, варьирование биохимического состава этих зерновых сред не имеет существенного значения для общего этапа синтеза поликетидных компонентов ОА и ЦИТ, а также для тех стадий, на которых происходит достраивание молекулы ОА аминокислотной частью и введение атома хлора (27).

У других 8 штаммов P. verrucosum обнаруженные количества ЦИТ оставались примерно в том же диапазоне, что и у продуцентов двух микотоксинов, но при этом ОА найден не был (см. табл. 2). Признавая этот вид фенотипически обособленным, исследователи обращают внимание на высокое генетическое разнообразие его популяций на злаках (28). Действительно, все штаммы, лишенные способности продуцировать ОА, были выделены из зерна злаковых — пшеницы, ячменя, овса, ржи, а также из гороха. Источниками контаминации отечественной зернопродукции, по-видимому, могут быть оба хемотипа гриба. По обобщенным данным за 2004-2009 годы, в кормовом зерне, кормосмесях, жмыхах наблюдалась общая закономерность в соотношении содержания этих токсинов: накопление ЦИТ было, как правило, выше, чем ОА, в 1,1-10 раз (29, 30), но эти исследования не сопровождались учетом пораженности P. verrucosum для контаминированных образцов.

При анализе двух образцов (пшеница и горох), наряду с P. verru-cosum, был обнаружен P. viridicatum, который не образовывал ОА и ЦИТ. Этот же вид как единственный мы выявили в одном из образцов ячменя. Нет сомнений в необходимости более подробно исследовать распространенность P. viridicatum в связи с его способностью продуцировать при заражении злаков ксантомегнины, известные своей высокой гепато- и нефротоксичностью, а также виридиновую кислоту — мало изученный микотоксин из группы тетрапептидов (25, 31). Отметим, что для оценки токсиген-ности изолятов Penicillium, контаминирующих зернопродукцию, современные морфологические приемы видовой идентификации должны быть дополнены молекулярными методами генотипирования и оценки представленности генов, ассоциированных с токсигенезом (32, 33).

Несмотря на малую выборку штаммов P. verrucosum из травяных кормов, на основании полученных нами данных можно сделать некоторые сопоставления. Тот же тип токсинообразования, что и у культур из зерновых объектов, с большей интенсивностью накопления ЦИТ, чем ОА (см. табл. 2), вполне соответствует общей ситуации с контаминацией луговых трав и сена (34). Ни один из образцов травяных кормов не был источником атипичных культур, не образующих ОА, и причиной этого, кроме редкой встречаемости вида, вполне может быть однородность его популяций в этих объектах. К сожалению, направленное изучение токсигенности вида P. verrucosum , ассоциированного с луговым разнотравьем, пока не проводилось.

Заслуживает внимания склонность P. verrucosum к адаптации биосинтеза вторичных метаболитов при изменении внешних условий (35, 36). Резкое смещение в сторону накопления ОА описано при шоковых воздействиях, например при чрезмерном засоления субстрата, окислительном стрессе в присутствии ионов меди (3), использовании глицерина или галактозы как источников углерода (2). По-видимому, именно с этим связан необычный результат, который получен при изучении коллекционных штаммов P. verrucosum (IBT, BioCentrum-DTU, Дания) на среде bread analogues из пшеничной муки с добавками маргарина, разрыхлителя, дрожжевого экстракта, глицерина и соли: три штамма образовывали ЦИТ и ОА в равном количестве или с преобладанием ОА и два — только ОА (37). Такая метаболическая пластичность гриба, безусловно, требует точного описания в условиях лабораторного тестирования. Нельзя исключать и то, что в природных популяциях также могут действовать факторы, приводящие к смещению равновесия в путях биосинтеза этих метаболитов. Так, многим вегетирующим луговым травам, как и зернопродукции, свойственна совместная контаминация ОА и ЦИТ, причем, как правило, с заметным количественным преобладанием ЦИТ (34). Однако в редких случаях отмечалось кратное увеличение содержания ОА и оба метаболита обнаруживались в сопоставимых количествах, например у солодки голой и в цветках клевера гибридного и клевера среднего (38).

В нашем исследовании абсолютное большинство (92 %) штаммов P. verrucosum накапливали ЦИТ в количествах более 10 мкг/г, из них у 48 % содержание ЦИТ составило ≥ 100 мкг/г, что позволяет считать их высокоактивными продуцентами (39). Напротив, ОА в количестве > 10 мкг/г выявили лишь у 12 % продуцирующих штаммов, причем остальная их часть была вообще лишена такой способности. Все это дает основания сомневаться в правомерности весьма распространенных в литературе указаний на то, что P. verrucosum является продуцентом ОА (14, 40, 41) при явной недооценке его способности накапливать ЦИТ (25). Как известно, оба метаболита образуются по общему пути, но если в идентификации генов, ответственных за биосинтез ОА, уже достигнуты значительные успехи (42), активно продолжается изучение факторов, оказывающих влияние на уровни транскрипции гена otapksPV и на остальные компоненты кластера, то в отношении ЦИТ пока прослеживают лишь аналогии с другими грибами, в частности с представителями рода Monascus (2, 43, 44). Выявление механизмов регуляции токсинообразования у грибов, составляющих природные популяции, становится одним из приоритетных направлений исследований. Развитие альтернативных методов типирования с помощью анализа про-теома и генетических маркеров (45) в ближайшем будущем позволяет наде- яться на их применение и в отношении токсигенных микромицетов, значимых для объектов гигиенического и санитарного контроля.

Таким образом, установлено, что в изученной группе изолятов Pen-icillium , ассоциированных с зерновыми и травяными объектами (образцы, использованные для выделения культур, были отобраны в разные годы на территории Российской Федерации), доминирующее положение принадлежит виду P. verrucosum , продуцирующему цитринин (от 5 до 180 мкг/г зернового субстрата) и охратоксин А (от 0,02 до 34 мкг/г), тогда как вид P. vi-ridicatum , который не способен к биосинтезу этих метаболитов, встречается редко. Полученные сведения указывают на возможную причастность P. ver-rucosum к сочетанной контаминации отечественной зернопродукции и травяных кормов цитринином и охратоксином А. Учитывая выраженные ответные реакции вида P. verrucosum на условия развития, следует продолжить микотоксикологическое изучение его популяций.