Сравнение двух альтернативных методов хроматографической очистки при получении препарата VIII фактора свертывания плазмы крови человека в дозировке 500 единиц / флакон

Гемофилия А является врожденным заболеванием, при котором нарушается свертывание крови. Лечение больных гемофилией А основано на регулярных инъекциях препарата фактора свертывания крови VIII. Препараты фактора VIII ежегодно входят в программу государственных гарантий оказания гражданам РФ бесплатной медицинской помощи, разрабатываемой Минздравсоцразвития РФ и утверждаемой Правительством РФ. В России такие препараты не производятся, поэтому сейчас 100% применяемых очищенных препаратов фактора свертывания VIII являются импортными [1, 3]. Это обуславливает актуальность разработки технологии для получения отечественного препарата фактора свертывания крови VIII.

В предыдущей публикации [4] нами представлен оригинальный способ (патент №2324495) получения препарата VIII фактора свертывания крови человека. Цель работы: сравнение эффективности очистки с использованием эксклюзионной (SЕC) и ионообменной хроматографий (IEC) и одной ионообменной хроматографии при получении препарата VIII фактора свертывания плазмы крови человека в дозировке 500 ЕД/фл.

Материал и методы

Препарат VIII фактора получали из свежезамороженной плазмы крови (СЗП) по технологической схеме, фактически состоящей из следующих этапов:

Таблица 1

Характеристика раствора криопреципитата и элюата, полученных при очистке методом 1 (SEC+IEC) и методом 2 (IEC) (M±m)

Наименование объекта исследования	Концентрация VIII фактора свертывания [ЕД/мл]	Содержание общего белка [мг/мл]	Удельная активность VIII фактора свертывания [ЕД/мг]	Три-н-бутил-фосфат, [мкг/мл]	Тритон Х100 [мкг/мл]	Выход фактора VIII [%]	Коэффициент вариации показателя “Выход фактора VIII” [%]
Вирусинактивиро-ванный криопре-	11±3	50±12	0,19±0,05	3000	10000	35±7*	20
ципитат n=13 SEC+IEC n=6	60±8	2,2±0,5	28±8	0,2±0,1	0,3±0,1	57±5**	8,8
IEC n=7	50±9	3,6±0,3	12±3	0,8±0,2	0,6±0,2	70±10**	14,3

Примечание: M – среднее арифметическое значение по выборке; m – стандартное отклонение по выборке; n – объем выборки; * – по отношению к свежезамороженной плазме; * – по отношению к содержанию фактора VIII в растворе криопреципитата.

– разморозка СЗП при температуре 3–4 °С до полного исчезновения льда и формирования отчетливо видимого осадка [5, 15];

– отделение осадка (криопреципитата) центрифугированием на проточной центрифуге ОТР101-К1 (Россия) при 15000 об/мин в течение (40±10) мин;

– растворение криопреципитата в цитратном буфере в соотношении 1:4 при температуре (25±2) °С в течение 30 мин. Соотношение “буфер : криопреципитат” было 4 л : 1 кг соответственно;

– удаление нерастворимого осадка из раствора криопреципитата центрифугированием при 2500 g в течение 10 мин;

– вирусинактивирующая обработка раствора криопреципитата сольвент-детергентным методом в течение 6 часов при температуре (27±2) °С с использо-

Рис. 1. Профиль элюции раствора криопреципитата при ионообменной хроматографии SEC-элюата (метод 1) и активность фактора VIII в разных хроматографических пиках:

- - активность фактора VIII, ЕД/мл;

– оптическая плотность при длине волны 280 нм, mAU

ванием в качестве вирусинактивирующих агентов три-н-бутилфосфата и Тритона Х-100 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия) в конечных концентрациях 0,3 и 1% соответственно [6, 7, 9];

– осветляющая фильтрация вирусинактивированного раствора с использованием префильтров с диаметром пор 5 мкм (ООО “Палл Евразия”, Москва).

Далее фильтрат подвергался хроматографической очистке двумя альтернативными методами.

Метод 1 с использованием SEC и IEC:

– очистка фильтрата с помощью SEC, для чего вируси-нактивированый раствор криопреципитата наносили на хроматографическую колонну PI200/750 (YMC Europe, Германия) с сорбентом Sepharose 4FF (GE Healhcare Bio-Sciences AB, Швеция) на скорости 60±20 см/ч при давлении в хроматографической системе (2,5±0,5) бара, при комнатной температуре;

– сбор элюата, содержащего фактор VIII, добавление стабилизаторов;

– доочистка и концентрирование полученного хроматографического элюата с помощью IEC, для чего элюат наносили на хроматографическую колонну XK50/30 (GE Healhcare Bio-Sciences AB, Швеция) c сорбентом DEAE-Toyopearl 650M (Tosoh corporation, Япония) на скорости 70±20 см/ч при давлении в хроматографической системе (2,5±0,5) бара;

Метод 2 с использованием одной IEC:

– очистка и концентрирование фильтрата с помощью IEC, для чего вирусинактивированный раствор криопреципитата наносили на хроматографическую колонну XK50/30 c сорбентом DEAE-Toyopearl 650M на скорости 50±20 см/ч при давлении в хроматографической системе (2,5±0,5) бара;

После хроматографической очистки методами 1 и 2 следовали следующие этапы:

Таблица 2

Аналитические данные показателей качества препарата с дозировкой 500 ЕД/фл, произведенного с использованием очистки эксклюзионной и ионообменной хроматографий

Наименование показателя качества	№600410	№610610	№620710
1	2	3	4
Описание. Аморфный порошок или пористая масса от белого до светло-желтого цвета	Пористая масса белого цвета	Пористая масса белого цвета	Пористая масса белого цвета
Подлинность. Препарат должен содержать: фактор VIII, натрий-ион, хлор-ион, сахарозу	Обнаруживается активность фактора VIII. Качественные реакции на натрий-ион, хлор-ионы и сахарозу положительные	Обнаруживается активность фактора VIII. Качественные реакции на натрий-ион, хлор-ионы и сахарозу положительные	Обнаруживается активность фактора VIII. Качественные реакции на натрий-ион, хлор-ионы и сахарозу положительные
Растворимость. Содержимое бутылки (флакона) с препаратом должно растворяться в 20 мл воды для инъекций в течение 20 мин при легком покачивании при комнатной температуре	Содержимое флакона с препаратом растворяется в 20 мл воды для инъекций в течение 20 мин при легком покачивании при комнатной температуре	Содержимое флакона с препаратом растворяется в 20 мл воды для инъекций в течение 20 мин при легком покачивании при комнатной температуре	Содержимое флакона с препаратом растворяется в 20 мл воды для инъекций в течение 20 мин при легком покачивании при комнатной температуре
Прозрачность. Должен выдерживать сравнение с эталоном IV	Выдерживает сравнение с эталоном IV	Выдерживает сравнение с эталоном IV	Выдерживает сравнение с эталоном IV
Цветность. Должен выдерживать сравнение с эталоном Y6	Выдерживает сравнение с эталоном Y6	Выдерживает сравнение с эталоном Y6	Выдерживает сравнение с эталоном Y6
Механические включения. Должен выдерживать требования РД 42-501-98	Выдерживает требования РД 42-501-98	Выдерживает требования РД 42-501-98	Выдерживает требования РД 42-501-98
рН. От 6,6 до 7,4	7,1	6,9	7,0
Белок. Не более 1,0%	0,3%	0,5%	0,6%
Потеря в массе при высушивании. Не более 5%	2,6%	2,8%	3,0%
Активность фактора VIII. От 400 до 600 ЕД/ фл	480 ЕД/фл	450 ЕД/фл	480 ЕД/фл
Удельная активность. Не менее 1 ЕД/мг белка	7 ЕД/мг белка	5 ЕД/мг белка	4 ЕД/мг белка
Калий-ион. Не более 4 мг/л	1 мг/мл	3 мг/мл	3 мг/мл
Пирогенность. Должен быть апирогенным	Апирогенный	Апирогенный	Апирогенный
Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным	Нетоксичный	Нетоксичный	Нетоксичный
Стерильность. Должен быть стерильным	Стерильный	Стерильный	Стерильный

– сбор элюата, содержащего фактор VIII, добавление стабилизаторов, заморозка при температуре минус (50±5) °С;

– контроль качества размороженного элюата;

– объединение партий размороженного элюата в лабораторно-промышленную серию, осветляющая и стерилизующая фильтрация промежуточного продукта;

– сублимационная сушка и контроль лиофилизированного препарата с дозировкой 500 ЕД/фл.

Контроль качества размороженного элюата проводили по следующим показателям:

– концентрация (активность) VIII фактора свертывания. Определяли методом измерения активированного частичного тромбопластинового времени с использованием коммерческих наборов (“НПО Ренам”, Мос- ква), в качестве стандарта использовали плазму с аттестованной активностью фактора VIII (“НПО Ренам”, Москва);

выход фактора VIII. Определяли как отношение общего количества фактора VIII в элюате после хроматографической очистки к общему количеству до хроматографической очистки;

содержание общего белка. Определяли биуретовым методом и методом Лоури [2];

удельная активность фактора VIII. Оценивали как отношение активности фактора VIII к количеству общего белка;

количество три-н-бутилфосфата. Определяли методом газовой хроматографии [10];

количество Тритона Х-100. Определяли методом об- ращенно-фазовой хроматографии [12].

Контроль качества лиофилизированного препарата с дозировкой 500 ЕД/фл проводили стандартными методами по показателям качества проекта ФСП на АнтигемоВир, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 500 ЕД. Дополнительное исследование молекулярномассового состава белков в исследуемом препарате в сравнении с препаратом Октанат проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия [14]. Пробы не были нормированы по содержанию белка. Денситометрию геля проводили с помощью программы Phoretix.1.0.

Результаты представлены в виде среднеарифметического значения с указанием среднеквадратичного отклонения. Коэффициент вариации рассчитывали в процентах как отношение среднеквадратичного отклонения к среднеарифметическому значению.

Результаты и обсуждение

Обобщенные данные, полученные при производстве 13 экспериментальных серий, представлены в таблице 1. Установлено что, 65% фактора VIII терялось на стадии криофракционирования СЗП. Следует отметить, что без стадии криофракционирования при производстве препаратов иммуноглобулина и альбумина белки, образующие криопреципитат, входят в состав осадка А8, который является отходом производства [8, 15], поэтому даже с потерями криофракционирование увеличивает рентабельность производства препаратов крови [5]. Несмотря на высокое содержание белка в криопреципитате, удельная активность фактора VIII в нем была низкая, так как основную массу криопреципитата составляют примесные белки (табл. 1). На стадии SEC при использовании метода 1 удалялось значительное

Рис. 2. Профиль элюции раствора криопреципитата при ионообменной хроматографии раствора криопреципитата (метод 2) и активность фактора VIII в разных хроматографических пиках:

- - активность фактора VIII, [ЕД/мл];

– оптическая плотность при длине волны 280 нм, [mAU]

Альблтшш, альфа, бета и гамма-цепи фибриногена

Mr[KDa]

Субъединицы комплекса фактор__

МП - фактор фон

Виллебранда

^—04

^—67

----60

----18.5

^—14.5

Рис. 3. Молекулярно-массовый состав исследуемого препарата и препарата Октанат с дозировкой 500 ЕД/фл: 1 – препарат “Октанат” (ОКТАФАРМА Фармацевтика, Австрия); 2 – исследуемый препарат (“НПО Вирион”); 3 – маркеры молекулярных весов, кДа

количество примесных белков, что повышало в 68 раз удельную активность фактора VIII по сравнению с раствором криопреципитата. Однако концентрация фактора VIII в SEC-элюате составляла 4,5±05 ЕД/мл, что было недостаточно для дальнейшего производства препарата [8]. Это обусловило необходимость введения стадии концентрирования. При производстве препаратов крови методами выбора для концентрирования являются ультрафильтрация и IEC [5, 11, 13]. Предпочтение было отдано методу IEC, так как он позволяет не только концентрировать, но и дополнительно очищать полупродукт [5, 8, 13]. Это подтверждает типичный профиль элюции, получаемый при нанесении SEC – элюата на ионообменную колонну (рис. 1).

Судя по этому профилю, в “проходной фракции” элюировались примесные белки, оставшиеся после SEC, с неопределяемой активностью фактора VIII. После очистки методом 1 удельная активность фактора VIII была в 147 раз выше по сравнению с раствором криопреципитата. Выход фактора VIII относительно раствора криопреципитата при очистке методом 1 был 1,2 раза ниже по сравнению с методом 2 (табл. 1). При этом коэффициент вариации значений выхода был в 1,6 раза ниже по сравнению с методом 2, что указывает на менее стабильный выход при использовании метода 2 (табл. 1). Возможно, это было связано с разной концентрацией общего белка в растворе криопреципитата, наносимого на ионообменную колонну. Так, концентрация общего белка в растворе криопреципитата варьировала от 32 до 65 мг/мл. Несмотря на то, что условия IEC при методе 2 были подобраны таким образом, чтобы с ионообменными группами сорбента связывались только молекулы фактора VIII, возможно, происходило и неспецифическое связывание примесных белков раствора криопреципитата, что снижало емкость сорбента для целевого белка. В результате этого часть целевого белка не связывалась с сорбентом, а элюировалась вместе с примесями, что подтверждалось выявлением активности фактора VIII в “проходной фракции” IEC (рис. 2). Недостатком метода 2, кроме менее стабильного выхода, было то, что количество общего белка при его использовании было в 1,6 раз выше по сравнению с методом 1. Это обуславливало снижение удельной активности фактора VIII – интегрального показателя, характеризующего эффективность метода очистки. Так, при использовании метода 1 данный показатель был в 2,3 раза выше по сравнению с методом 2 (табл. 1). Это связано с тем, что метод 1 включает две стадии очистки: SEC и IEC. На стадии SEC удалялось основное количество белковых примесей, за счет чего снижались общее количество белка и вязкость раствора. В результате целевой белок более эффективно связывался с ионообменными группами сорбента. Следовательно, проведение SEC перед IEC обеспечивало более эффективное удаление примесей по сравнению с методом 2.

Следует отметить, что как после очистки методом 1, так и методом 2 удалялась основная часть вирусинакти-вирующих агентов, и их количество находилось в пределах допустимой нормы для препаратов фактора VIII (табл. 1) [7, 9].

Более низкий выход при использовании метода 1 в конечном итоге может обуславливать более высокую цену препарата, полученного с использованием этого метода. Однако в настоящее время основное внимание во всем мире уделяется именно степени очистки белков с направленным терапевтическим действием, полученных из плазмы крови, поэтому при получении препарата фактора VIII с дозировкой 500 ЕД/мл технологическая схема, включающая метод 1, представлялась более перспективной. В таблице 2 представлены основные показатели качества 3 серий препарата с дозировкой 500 ЕД/фл, произведенного в 2010 г. с использованием метода 1. Исследование молекулярно-массового состава образцов произведенного препарата в сравнении с зарегистрированным и широко применяемым в настоящее время в России препаратом “Октанат” (500 ЕД/фл, производитель ОКТАФАРМА Фармацевтика, Австрия), показало, что по молекулярно-массовому составу вышеуказанные препараты сопоставимы (рис. 3), что указывает на возможность замещения дорогостоящих импортных аналогов высококачественным отечественным препаратом VIII фактора свертывания.

Заключение

Комбинирование эксклюзионной и ионообменной хроматографий является предпочтительным методом очистки при получении препарата VIII фактора свертывания плазмы крови человека с дозировкой 500 ЕД/фл по сравнению с очисткой одной ионообменной хроматографией.