Сравнение двух методов отбора агрессивных для подсолнечника изолятов Phoma macdonaldii Boerema

Введение. Возбудитель фомоза Phoma macdonaldii (Boerema et al., 2004), с теле-оморфной стадией развития Leptosphaeria lindquistii (Frezzi, 1968), поражает подсолнечник в России и других стран а х: Франции, Сербии, Югославии, Румынии, Болгарии, Аргентине, Канаде, Китае . П отери урожая при благоприятных для патогена условиях могут составлять от 30 до 70 % [1; 2]. Интенсивному распространению фомоза на юге России могли способствовать такие факторы, как расширение посевных площадей, занятых подсолнечником, применение севооборотов короткой ротации, изменение климата, импорт инфицированного семенного материала [3]. В силу перечисленных причин на полях происходит накопление растительных остатков, инфицированных патогеном, и формирование биотипов гриба высокой агрессивности. В сложившейся ситуации могут изменяться не только сроки появления симптомов болезни, но и интенсивность её течения, что влечёт за собой снижение урожая. Надёжным и экологически безопасным способом защиты подсолнечника от возбудителя фомо-за является селекция устойчивых сортов и гибридов. Для отбора генотипов подсолнечника, устойчивых к поражению возбудителем фомоза необходимо использовать высоко агрессивные его изоляты.

Для дифференциации моноспоровых культур гриба по агрессивности обычно используют следующие методы: 1 – определение скорости колонизации отдельных органов растения (площади поражённой поверхности) [4]; 2 – по ток-86

сичности метаболитов культурального фильтрата патогена для прорастающих семян (биопроба) [5].

Цель нашей работы: сравнить агрессивность изолятов Ph. macdonaldii для подсолнечника двумя разными методами и выбрать наиболее подходящий из них для использования при отборах селекционного материала, устойчивого к фомозу.

Материалы и методы. Выделение возбудителя фомоза из фрагментов растений подсолнечника и получение моноспоровых культур проводили с использованием общепринятой методики экспериментальной микологии на овсяной агаризованной среде (ОА). Видовую принадлежность определяли по систематике Boerema et al. (2004) [6]. Все выделенные изоляты представляли собой род Phoma, вид macdonaldii Boerema [7].

Ранее нами было установлено влияние на агрессивность изолятов субстрата, на котором их выращивали, возраста культуры и различных концентраций мицелиального инокулюма. Мы использовали следующие условия для дифференциации изолятов Ph. macdonaldii по размеру поражённой поверхности отсечённых семядольных листьев: культуральная среда – овсяный агар (ОА), температура – 25 оС, период контакта отсечённых семядолей и гипокотиля с колониями гриба – двое суток [8]. Критерием агрессивности в ранних исследованиях служил процент поражённой поверхности отсечённых семядольных листьев 10-дневных растений подсолнечника сорта ВНИИМК 8883, гибрида Альтаир и линии ВК 653, помещённых на двое суток на поверхность 14-дневных моноспоровых культур, выращенных на питательной среде ОА. В чашки Петри с моноспоровыми культурами гриба помещали 8–9 отчленённых семядольных листьев одного генотипа подсолнечника. Исследования проводили в двух повторностях для каждого генотипа. В контрольном варианте семядольные листья раскладывали на питательную среду без колоний гриба. Вычисляли средний процент поражённой поверхности семядольных листьев трёх генотипов подсолнечника.

Метод биопробы основан на способности токсинов, продуцируемых патогеном, подавлять рост растений [5]. Критериями агрессивности в этом случае служили количество непроросших и аномально проросших семян подсолнечника, а также длина гипокотиля и корня внешне здоровых проростков. В опыте использовали восприимчивый сорт ВНИИМК 8883 и толерантный гибрид Альтаир. Модифицированную жидкую питательную овсяную среду (О) готовили следующим образом: 150–200 г овсяных зерен варили в одном литре воды в течение 20 минут, сцеживали отвар и добавляли в него 20 г глюкозы. Для картофельно-глюкозной среды вместо овса использовали 200 г картофеля. Отвар разливали в колбы и автоклавировали при 1,2 атм. 30 минут. Равные высечки 14-дневных моноспоро-вых колоний гриба помещали по отдельности в колбы объёмом 150 мл, заполненные на 1/3 жидкой картофельноглюкозной (КГ) либо овсяной (О) средами и инкубировали 30 суток при температуре 25 ^оС. После этого выросшие колонии гриба удаляли, а культуральную жидкость фильтровали через бумажные фильтры. Семена подсолнечника предварительно промывали в проточной воде, затем в 0,01%-ном растворе KMnO 4 и замачивали в равных объёмах фильтратов на сутки, раскладывали на увлажнённую фильтровальную бумагу по 50 штук в каждой повторности и свёртывали её в рулоны. На один вариант – четыре повторности. В качестве контрольного варианта семена замачивали в стерильной воде. Семена проращивали в рулонах при температуре 22–25 ^оС. На пятые сутки учитывали количество непроросших и сгнивших семян, измеряли длину здорового гипокотиля и главного корня. Для оценки достоверности различий по количеству непроросших семян использовали дисперсионный анализ [9].

Результаты и обсуждение. В результате проведённых исследований установлена вариабельность агрессивности изолятов Ph. macdonaldii. Через двое суток контакта отсечённых семядольных листьев с культурами изолятов наблюдались различия между ними по площади колонизированного участка листа, что хорошо видно на восприимчивом сорте ВНИИМК 8883. Выделился изолят № 14, который колонизировал всю поверхность семядольных листьев подсолнечника этого сорта (рис. 1).

№ 14        № 4        № 36

Рисунок 1 – Поражение отчленённых семядольных листьев проростков подсолнечника сорта ВНИИМК 8883, помещённых на колонии моноспоровых изолятов Phoma macdonaldii № 14, 4 и 36, 2018 г. (ориг.)

При характеристике агрессивности каждого изолята Ph. macdonaldii учитывали влияние генотипа подсолнечника, для этого им заражали сорт, гибрид и линию. По усреднённому размеру поражённой площади семядольных листьев трёх генотипов подсолнечника, провели ранжирование изученных изолятов по 4-балльной шкале, характеризующей степень агрессивности:

• 1    – очень слабая (поражено не более 10 % площади семядольного листа);

• 2    – слабая (поражено от 11 до 30 % площади семядольного листа);

• 3    – средняя (поражено от 31 до 50 % площади семядольного листа);

• 4    – сильная (поражено более 50 % площади семядольного листа).

Большая часть изолятов    Ph.

macdonaldii проявила слабую и среднюю степень агрессивности. Из общего количества изученных изолятов (более 60) бы- ли выделены девять с максимальным баллом (4) степени агрессивности (рис. 2).

Рисунок 2 - Распределение по баллам степени агрессивности общего количества изученных изолятов Phoma macdonaldii через двое суток контакта семядольных листьев подсолнечника с моноспоровыми колониями изолятов гриба (1 - очень слабая; 2 - слабая; 3 - средняя; 4 - сильная)

Для подтверждения известной степени агрессивности пяти изолятов Ph. macdonaldii провели испытание этих изо-лятов по токсичности метаболитов их культуральных жидкостей для семян и проростков подсолнечника восприимчивого сорта ВНИИМК 8883 и толерантного гибрида Альтаир. Культуральная жидкость представляла собой фильтрат жидкой питательной среды, на которой культивировали исследуемый изолят гриба. Он содержал токсичные метаболиты жизнедеятельности гриба [5].

Ингибирующее воздействие культуральных фильтратов на прорастание семян восприимчивого сорта ВНИИМК 8883 отмечалось у всех изолятов гриба. На рисунке 3 представлены проростки сорта ВНИИМК 8883 с аномальным развитием, после воздействия культурального фильтрата изолята Ph. macdonaldii № 14.

Количество нежизнеспособных семян этого сорта вследствие обработки их культуральными фильтратами было значительно больше, чем у толерантного гибрида Альтаир. Аномальное развитие корня (отсутствие боковых корней, отгнивший главный корень) также чаще отмечалось у проростков сорта, чем у гибрида. На контрольном варианте с водой у обоих генотипов было отмечено неболь-88

шое количество нежизнеспособных семян: у сорта - 5, а у гибрида - 2, что можно объяснить наличием семяной инфекции.

Рисунок 3 - Аномально развитые проростки подсолнечника восприимчивого сорта ВНИИМК 8883 после воздействия на семена культурального фильтрата изолята № 14 Phoma macdonaldii (ориг.)

Токсичность культурального фильтрата зависела от субстрата, на котором выращивались изоляты. Фильтрат, полученный от культивирования некоторых изолятов на овсяной среде (О), был более токсичен для прорастающих семян подсолнечника по сравнению с фильтратом от культивирования на картофельноглюкозной (КГ) среде. Отличительной особенностью при культивировании на разных средах было то, что у всех изученных изолятов гриба на среде КГ сформировалась большая мицелиальная масса, а на О образовалось большее количество пикнид. Угнетение прорастания семян сорта ВНИИМК 8883 наблюдалось после воздействия всех культуральных фильтратов с наивысшим баллом степени агрессивности, полученных на обеих питательных средах по сравнению с контрольным вариантом - водой. Однако, изученные изоляты, выращенные на КГ среде, практически не различались между собой по общему количеству нежизнеспособных семян сорта ВНИИМК 8883, что подтверждают результаты статистики, приведённые в таблице.

Таблица

Влияние культурального фильтрата изо-лятов Phoma macdonaldii на прорастание семян подсолнечника

Сорт, гибрид	Изо-лят	*Количество семян, штук
		непроросших		аномально проросших		сгнивших		всего, нежизнеспособных
		**КГ	***О	КГ	О	КГ	О	КГ	О
ВНИИМК 8883	4	11	12	4	5	0	0	15	17
	5	5	6	2	4	7	0	14	10
	11	1	8	8	5	8	1	17	14
	14	5	7	8	6	3	2	16	15
	25	4	8	6	8	5	2	15	18
	Контроль – вода	2	1	0	0	3	4	5	5
НСР 05                                                         3,9
Альтаир	4	1	1	2	2	1	1	4	4
	5	2	1	1	2	2	1	5	4
	11	1	0	1	3	1	2	3	5
	14	1	2	3	1	1	2	5	5
	25	1	0	2	2	1	4	4	6
	Контроль – вода	0	0	0	0	2	1	2	1
НСР 05                                                         0,7

* – Общее количество семян в каждом варианте 100 штук

** КГ – картофельно-глюкозная среда;

***О – овсяная среда

Прорастание семян гибрида Альтаир в большей степени ингибировали фильтраты изолятов № 11, 14 и 25, выращенных на О среде. Изолят № 4, независимо от субстрата, отличался наибольшим ингибирующим действием на прорастание семян сорта ВНИИМК 8883: на КГ среде не проросло 11 семян, а на овсяной среде – 12, что значительно превысило другие варианты (таблица).

Таким образом, метаболиты всех изученных изолятов, выращенных на обеих средах, в большей степени угнетали прорастание семян сорта ВНИИМК 8883, чем гибрида Альтаир. По количеству нежизнеспособных семян сорта и гибрида из пяти изолятов выделился изолят № 25, выращенный на О среде – 18 и 6 штук соответственно.

Изоляты различались по характеру воздействия культуральных фильтратов на прорастание семян и рост корня подсолнечника. Если на прорастание семян обоих генотипов в большей степени влияли метаболиты культуральных фильтратов изолятов, полученных на ов- сяной среде, то на длину гипокотиля и корня проростков – выращенных на КГ среде. Размеры гипокотиля сорта и гибрида в вариантах были значительно меньше по сравнению с контролем (рис. 5, 6). Наиболее угнетающее действие на рост гипокотиля и на сорте, и на гибриде оказали изоляты под номерами 25, 5 и 14, которые были выращены на КГ среде (рис. 5 и 6).

Рисунок 5 – Длина гипокотиля проростков подсолнечника сорта ВНИИМК 8883 после воздействия на семена культурального фильтрата изолятов Phoma macdonaldii , выращенных на картофельно-глюкозной и овсяной средах

Рисунок 6 – Длина гипокотиля проростков подсолнечника гибрида Альтаир после воздействия на семена культурального фильтрата изолятов Phoma macdonaldii, выращенных на картофельно-глюкозной и овсяной средах

Длина главного корня у проростков варьировала в зависимости от генотипа подсолнечника, а также от среды, на которой культивировали изоляты Ph.

macdonaldii . Сильное угнетающее действие на рост главного корня у проростков сорта ВНИИМК 8883 оказали культуральные фильтраты изолятов № 5, 11 и 25, выращенные на КГ среде и № 11, 14 – на овсяной среде (рис. 7).

Рисунок 7 – Длина главного корня проростков сорта ВНИИМК 8883 после воздействия на семена культурального фильтрата изолятов Phoma macdonaldii , выращенных на картофельно-глюкозной и овсяной средах

Большее угнетающее действие на рост корня проростков гибрида оказали культуральные фильтраты изолятов № 11 и № 14, полученные на КГ среде, и № 14 – на овсяной среде (рис. 8).

Рисунок 8 – Длина главного корня проростков гибрида Альтаир после воздействия на семена культурального фильтрата изолятов Phoma macdonaldii, выращенных на картофельно-глюкозной и овсяной средах

Полученные результаты биопробы (определение агрессивности гриба по токсичности его метаболитов на прорас-90

тание семян, рост главного корня и гипокотиля) совпали с полученными данными по оценке этого признака по размеру поражённой площади семядольного листа после двухдневного контакта с культурами Ph. macdonaldii . Отмечена сильная зависимость токсичности фильтрата изученных изолятов для прорастающих семян подсолнечника от субстрата, на котором были выращены их культуры. У одних изолятов ингибирующее влияние токсинов в большей степени проявлялось на картофельно-глюкозной среде, а у других – на овсяной.

Выводы. В результате сравнительной оценки агрессивности изолятов Ph. macdonaldii двумя методами получены сходные результаты. Подтверждена агрессивность выделенных первым методом изолятов возбудителя фомоза. Оба метода могут быть использованы для оценки агрессивности изолятов гриба. Однако зависимость токсичности фильтрата от субстрата, на котором были выращены изоляты, а также высокая трудоёмкость этого метода делает его менее привлекательным для использования в скрининге агрессивных изолятов.

Для создания высоко агрессивного инокулята или инфекционных фонов при селекции подсолнечника на устойчивость к фомозу рекомендовано использовать смесь изолятов № 25, 11, 14.