Сравнение функционально-технологических свойств и аминокислотного состава изолятов белка растительного происхождения

Введение. Ежегодно спрос на белки растительного происхождения увеличивается. Согласно прогнозам Markets and Markets, мировой рынок растительных белков вырастет с 10,3 млрд до 14,5 млрд долл. в период с 2020 по 2027 г. при среднем приросте 7,1 % в год [1]. В России большая часть растительных белков представлена зарубежными компаниями, в связи с этим особо востребованы технологии получения изолятов белка на основе отечественного сырья, имеющих высокий потенциал практической реализации.

Существенным недостатком производства животного белка является низкая эффективность конверсии растительного сырья. Для получения 1 кг животного белка в среднем расходуется 6 кг растительного белка [2]. В этой связи целесообразно увеличить использование растительного сырья для получения пищевого белка. Альтернативные белковые источники в сравнении с традиционными имеют низкую стоимость и широко доступны.

В пищевой промышленности все большую актуальность приобретают растительные белковые ингредиенты – изоляты, концентраты и текстураты белка [3]. Эти белковые добавки применяют при производстве пищевых продуктов благодаря их высокой питательной ценнос- ти и хорошему взаимодействиею с другими ингредиентами, однако их функциональнотехнологические свойства (ФТС) зависят от способа получения и источника белка. К функционально-технологическим свойствам относятся растворимость белка, водосвязывающая (ВСС) и жиросвязывающая (ЖСС) способности, жироэмульгирующие свойства (ЖЭС) и стабильность эмульсий (СЭ), пенообразующая способность (ПС) и стабильность пены (СП) [4].

Основными источниками растительного белка являются масличные, бобовые и злаковые культуры [1]. Наибольшую коммерческую распространенность получили соя, пшеница и кукуруза [5]. Для удовлетворения увеличивающегося с каждым годом спроса на растительные белки и увеличения их ассортимента активно ведутся поиски альтернативных источников.

Недорогими источниками белка являются бобовые культуры. В бобах нута содержание белка достигает 29 %, который характеризуется сбалансированным соотношением незаменимых аминокислот [6]. В сравнении с соевыми белки нута обладают более низкой аллергенностью [7]. Актуальность переработки бобов нута для извлечения белка подтверждается значительным ежегодным приростом мирового рынка в 11,2 %, а к 2025 г. его объем в денежном эквиваленте составит 737,8 млн долл. [6]. Однако в настоящий момент не налажено коммерческое производство белковых изолятов нута. Недавно в рамках стартапа на базе Еврейского Университета в Иерусалиме была разработана технология получения белкового изо-лята нута ChickP компании ChickP. Однако на рынке представлен белковый концентрат нута CP-PRO 70 компании Innovopro Ltd (Израиль).

В России каждый год отмечается увеличение урожая рапса, возрастает объем отходов переработки – жмыхов и шротов, содержащих большое количество белка – до 42 % в шроте и до 35–38 % в жмыхе [8]. Помимо использования отходов переработки рапса в качестве корма их можно использовать как источник белка для пищевой промышленности. Сообщается о сбалансированном аминокислотном составе белка рапса и высокой усвояемости – 84 % [9]. Недавно на зарубежном рынке были зарегистрированы белковые препараты рапса под коммерческими названиями Supertein и Puratein (Burcon NutraScience Co, Канада), имеющие статус GRAS [10], а также Isolexx (TeuTexx Proteins,

Германия), получивший положительное заключение EFSA [11].

Производство коммерчески доступных изо-лятов белка нута и рапса в России до сих пор не налажено. Ключевую роль при оценке качества белка играет аминокислотный профиль, а также усвояемость белка [12].

Цель исследования – сравнение функционально-технологических свойств и аминокислотного состава изолятов белка нута и рапса, полученных путем обезжиривания, предобработки целлюлолитическими ферментными препаратами, щелочной экстракции и кислотным осаждением в изоэлектрической точке.

Задачи: определить аминокислотный профиль и функционально-технологические свойства полученных изолятов белка нута и рапса в сравнении с коммерческими образцами; сделать вывод о возможности использования изо-лятов белка нута и рапса в качестве пищевых ингредиентов; предложить рекомендации по способу модификации функционально-технологических свойств полученных изолятов белка.

Объекты и методы. Для исследования был выбран нут типа кабули. Изолят белка нута получен из бобов, которые предварительно измельчали и обезжиривали н-гексаном, проводили ферментативную предобработку с использованием ФП «ЦеллоЛюкс А» (ООО «Сиббиофарм», Россия), затем щелочную экстракцию и изоляцию белков согласно Патенту № 2803851 [13].

Получение изолята белка осуществлялось согласно Патенту № 2815553 [14]. Жмых рапса ярового сорта «Ермак» измельчали на роторной ударной мельнице, затем проводили предобработку измельченного жмыха подкисленной водой при pH 4,0, жмых отделяли от экстракта и обезжиривали н-гексаном. Проводили ферментативную предобработку с помощью ФП Rovabio max АР (Adisseo, Франция), щелочную экстракцию и осаждение белков из экстракта.

Для сравнения качественных характеристик полученных изолятов использовали коммерческие белковые препараты: изолят гороховый (АО «ОХК «Уралхим», Россия) и изолят белка сои Shansong-90 (Linyi Shansong Biological Products Co., Китай).

Влажность образцов определяли в соответствии с ГОСТ 54951-2012, зольность – ГОСТ 34845-2022, определение содержания «сырого» протеина – ГОСТ 13496.4-2019.

Для оценки функционально-технологических свойств изолятов белка определяли долю растворимого белка, водосвязывающую, жиросвязывающую способности, жироэмульгирующие свойства и стабильность эмульсии, пенообразующие свойства и стабильность пены.

Долю растворимого белка определяли путем растворения 250 мг анализируемой пробы в 20 см3 0,1 М раствора NaCl при pH 7,0, перемешивании в течение 30 мин на магнитной мешалке US-1500D (ULAB, Китай) [15]. Затем проводили центрифугирование при 20 000 g в течение 30 мин, далее определяли содержание белка в фугате по методу Лоури. Выражали долю растворимого белка в процентах по отношению к его содержанию в анализируемом образце.

Для определения водосвязывающей способности исследуемых образцов готовили суспензию 0,5 г навески в 5 см3 дистиллированной воды, встряхивали в течение 10 с каждые 5 мин в течение 30 мин и центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин [16]. ВСС, выраженную в %, рассчитывали, как отношение массы анализируемого образца после центрифугирования к массе исходного образца.

Жиросвязывающую способность определяли путем смешивания 0,5 г навески и 5 см3 подсолнечного масла. Приготовленную суспензию встряхивали в течение 10 с каждые 5 мин в течение 30 мин, затем центрифугировали 15 мин при 1000 g [16]. Величину ЖСС в % определяли как отношение массы навески после центрифугирования к массе исходного образца.

Определение жироэмульгирующих свойств осуществляли путем гомогенизации образца массой 3,5 г в 50 см3 дистиллированной воды с использованием гомогенизатора STEGLER DG-360 (STEGLER, Китай) при 10 000 об/мин в течение 30 с. К суспензии добавляли 50 см3 подсолнечного масла и повторно гомогенизировали в течение 120 с. Эмульсию переносили в две центрифужные пробирки и центрифугировали при 1100 g в течение 5 мин. Жироэмульгирующие свойства рассчитывали путем деления объема эмульгированного слоя на объем эмульсии перед центрифугированием [15].

Для определения стабильности эмульсии приготовленную эмульсию перед центрифугированием нагревали до 85 °С в течение 15 мин, охлаждали, затем охлажденную эмульсию переносили в две центрифужные пробирки и центрифугировали при 1100 g в течение 5 мин [15].

Пенообразующую способность определяли путем приготовления 50 см3 3 % раствора анализируемой пробы в дистиллированной воде, после чего гомогенизоровали при 10 000 об/мин в течение 60 с, затем суспензию переносили в мерный цилиндр на 250 см3 и измеряли объем пены в процентах от общего объема. Стабильность пены выражали в процентах, как объем пены, остающийся спустя 20 мин, отнесенный к общему объему [15].

Анализ аминокислотного состава исследуемых образцов изолята белка определяли на основе ГОСТ 34132-2017. Для анализа отбирали предварительно высушенную и обезжиренную навеску образца изолята белка массой (10,0 ± 0,1) мг, проводили гидролиз концентрированной соляной и пропионовой кислотами (соотношение 50 : 50) при температуре 110 °С в течение 18 ч, после чего гидролизат упаривали. К упаренному досуха гидролизату добавляли 1 см3 буфера (pH 2,2), количественно переносили в виалу. Для первичных аминокислот с целью предколоночной дериватизации с использованием системы автосемплера ВЭЖХ Agilent 1260 Inf1nity LC (Agilent Technologies, США) использовали ортофталевый альдегид, для вторичных – 9-фторметилхлорформиат. Хроматографическое разделение проводили с использованием колонны ZORBAX С18 РА 3,5 мкм 4,6 × 150 мм (Agilent Technologies, США) в режиме градиентного элюирования в течение 25 мин.

Расчет аминокислотного скора (АС), коэффициента различия аминокислотного скора (КРАС) и биологической ценности (БЦ) исследуемых образцов изолятов белка осуществляли в соответствии с методикой, предложенной в работе Д.Р. Тазеддиновой и А.Д. Тошева (2022) [17].

Обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием программного пакета MS Excel в ходе которой определяли среднее значение искомой величины при 3-кратной повторности, а также среднеквадратическое отклонение и доверительный интервал. Величина доверительной вероятности составляла 95 %.

Результаты и их обсуждение. В изоляте белка нута содержание основного вещества составило (90,51 ± 2,26) %, в изоляте рапса – (90,75 ± 2,27) %. Полученные данные согласуются со значениями, представленными в работах [18, 19]. Изолят сои Shansong-90 содержит (90,58 ± 2,26) % белка, изолят гороха «Уралхим» содер- жит менее 90 %. Характеристика исследуемых изолятов белка приведена в таблице 1.

Содержание золы в изолятах нута и рапса значительно ниже, чем в изоляте гороха, но находится на одном уровне с изолятом сои. По внешнему виду все образцы представляют собой однородный мелкодисперсный порошок светло-бежевого цвета. Изоляты нута, рапса и сои обладают нейтральными органолептическими параметрами, в отличие от изолята гороха, имеющего незначительный характерный гороховый привкус.

Таблица 1

Показатель	Образец
	Изолят нута	Изолят рапса	Изолят сои Shansong-90	Изолят гороха «Уралхим»
Содержание «сырого» протеина, % от СВ*	90,51±2,26	90,75±2,27	90,58±2,26	88,71±2,21
Зола, % от СВ	2,59±0,12	3,91±0,35	5,18±0,46	4,83±0,43
Массовая доля влаги, %	4,34±0,15	6,42±0,12	7,03±0,14	5,94±0,11
Внешний вид	Однородный мелкодисперсный порошок	Однородный мелкодисперсный порошок	Однородный мелкодисперсный порошок	Однородный мелкодисперсный порошок
Цвет	Светло-бежевый	Светло-бежевый	Светло-бежевый	Светло-бежевый
Органолептические параметры	Нейтральные	Нейтральные	Нейтральные	Незначительный гороховый привкус

СВ – сухие вещества.

Характеристика исследуемых изолятов белка

Characteristics of the studied protein isolates

Был получен и проанализирован аминокислотный профиль каждого исследуемого образца (рис. 1). Изоляты характеризуются сбалансированным аминокислотным профилем. Белковый изолят рапса превосходит остальные образцы по содержанию аспарагиновой кислоты ((12,35 ± 1,85) %), аланина (7,65 ± 1,15), гистидина (4,40 ± 0,66), глицина (5,04 ± 0,76), треонина (6,84 ± 1,03) и тирозина (3,76 ± 0,56), при минимальном значении, но удовлетворяющем требованиям ФАО/ВОЗ, серина (3,89 ± 0,58), цистеина (0,81 ± 0,12), валина (3,46 ± 0,52), изолейцина (3,08 ± 0,46), лейцина (4,53 ± 0,68), лизина (4,15 ± 0,62) и пролина ((2,48 ± 0,37) %). Похожий аминокислотный профиль установлен для коммерческих белков препаратов рапса Supertein и Puratein (Burcon NutraScience, Канада), Isolexx (TeuTexx Proteins, Германия) и Canola PRO (Koninklijke DSM N.V., Нидерланды) [20].

Изолят нута характеризуется максимальным количеством аргинина ((8,56 ± 1,28) %) и фенилаланина ((4,86 ± 0,73) %). Полученный аминокислотный состав изолята белка нута имеет большую корреляцию с данными работы Ramani A. et al. (2021) за исключением содержания аланина, цистеина, метионина, валина и аргинина [21]. Лимитирующими аминокислотами являются пролин ((3,75 ± 0,56) %) и метиоинин ((1,54 ± 0,23) %). Для изолята сои лимитирующей аминокислотой является Мет+Цис ((1,92 ± 0,28) %). В сравнении с другими образцами изо-лятов он содержит максимальное количество глутаминовой кислоты ((17,40 ± 2,61) %), лейцина (6,84 ± 1,02), валина (4,09 ± 0,61), изолейцина (3,92±0,58) и пролина ((4,31 ± 0,64) %). Гороховый изолят «Уралхим» наиболее сбалансирован в сравнении с другими изолятами.

Дефицит аминокислот в рационе питания человека вызывает нарушение метаболизма [22]. Незаменимые аминокислоты не синтезируются самостоятельно, должны поступать с пищей. С учетом аминокислотного профиля можно сделать вывод, что полученные изоляты белка нута и рапса могут быть использованы в рецептурах различных продуктов, почти не уступая изолятам сои.

20,00

18,00

16,00

14,00

12,00

10,00

8,00

6,00

4,00

2,00

0,00

Асп Глу Сер Гис Гли Тре Арг Ала Тир Цис Вал Мет Фен Иле Лей Лиз Про 12,35 13,85 3,89 4,40 5,04 6,84 7,18 7,65 3,76 0,81 3,46 1,28 3,33 3,08 4,53 4,15 2,48 10,00 17,40 4,90 2,49 3,34 3,10 6,92 4,06 3,18 0,91 4,09 1,01 4,30 3,92 6,84 5,80 4,31 10,46 14,40 3,71 2,43 3,74 3,05 7,51 3,71 2,43 1,26 3,97 1,54 3,88 3,46 6,04 6,07 3,46 10,68 15,89 4,57 2,50 3,85 3,37 8,56 3,89 2,24 1,23 4,07 1,54 4,86 3,89 6,44 6,04 3,75

• ■    ИБ рапса

• ■    ИБ сои

• ■    ИБ гороха

• ■    ИБ нута

Рис. 1. Сравнение аминокислотного состава изолятов белка нута, рапса, сои и гороха Comparison of amino acid composition of protein isolates of chickpeas, rapeseed, soy and peas

В таблице 2 представлены значения аминокислотного скора (АС), коэффициента различия аминокислотного скора (КРАС) и биологическая ценность (БЦ) исследуемых образцов. Расчет интегральных показателей биологической ценности полученных белков проводился относительно состава идеального белка по шкале ФАО/ВОЗ [23]. АС для рассматриваемых аминокислот изолята белка нута и гороха составляет более 100 %, белок рапса характеризуется недостаточным содержанием валина (АС 88,76 %), серосодержащих аминокислот (АС 94,75 %),

Таблица 2

Аминокислотный скор и биологическая ценность исследуемых изолятов белка Amino acid score and biological value of the studied protein isolates

лейцина (АС 85,47 %) и лизина (АС 92,12 %). Соевый изолят традиционно характеризуется дефицитом Мет и Цис (АС 86,88 %), что согласуется с литературными данными [24].

Наибольшую биологическую ценность (БЦ 80,27 %) имеет изолят гороха «Уралхим». БЦ изолятов рапса составляет 61,28, нута – 75,84 %. Значение БЦ для изолята сои Shansong-90 составило 66,35 %. При этом в работе Е.Е. Курчае-вой и др. (2017) БЦ изолята белка рапса была выше, чем у соевого изолята [25].

Образец	Аминокислотный скор							КРАС, %	БЦ, %
	Тре	Тир +Фен	Вал	Мет +Цис	Иле	Лей	Лиз
Изолят нута	146,63	186,60	104,29	125,28	129,07	121,46	134,19	24,16	75,84
Изолят рапса	297,29	186,19	88,76	94,75	102,22	85,47	92,12	38,72	61,28
Изолят сои Shansong-90	134,78	196,33	104,87	86,88	130,23	129,06	128,89	33,65	66,35
Изолят гороха «Уралхим»	132,61	165,68	101,91	126,95	115,10	113,89	134,84	19,73	80,27

В связи с перспективой применения полученных изолятов в качестве пищевых добавок большое значение имеют их функциональнотехнологические свойства. ФТС состоят из комплекса показателей, значения которых позволяют прогнозировать способность изолятов участвовать в формировании структурных и физико-химических характеристиках пищевых продуктов [26].

Профили растворимости для изолятов нута и рапса при значении pH 7,0 ± 0,1 достаточно схожи – (21 ± 1,5) и (26 ± 1,7) % (рис. 2).

• ■    Изолят белка рапса             ■ Изолят белка нута

• ■    Изолят белка сои «Shansong-90» □ Изолят белка гороха «Уралхим»

Рис. 2. Профили растворимости изолятов белка рапса, нута, сои Shansong-90 и гороха «Уралхим» при значении pH 7,0 ± 0,1

Solubility profiles of protein isolates of rapeseed, chickpeas, soy Shansong-90 and Uralchem peas at pH 7.0 ± 0.1

В работе Floris et al. (2008) было показано, что снижение растворимости, т. е. образование белковых агрегатов, связано с окислением SH-группы [27, 28]. Незначительно более высокую растворимость имеет изолят белка гороха ((49 ± 2,4) %), в то время как максимальное значение установлено для изолята сои ((64 ± 3,2) %). Данный показатель служит мерой степени денатурации белка, что позволяет определить пищевые продукты или напитки, в которые изолят может быть добавлен.

В ходе определения ВСС (рис. 3) наибольшее значение установлено для соевого изолята ((600 ± 30) %), что согласуется с данными Ma et al. (2022). По данному показателю наиболее приближен к соевому изоляту гороховый изолят «Уралхим» ((520 ± 26) %). Наименьшую ВСС имеют образцы изолята нута ((388 ± 19) %) и рапса ((310 ± 15) %). Для белков нута данный показатель по литературным данным находится в диапазоне от 234 до 431 % [29], для белков рапса значение в среднем ВСС составляет от 160 до 290 % [18, 30].

к ru S’ 2

(П к 01

о CL

Изолят белка рапса Изолят белка нута    Изолят белка сои Изолят белка гороха

«Shansong-90»         «Уралхим»

• ■    ВСС ■ ЖСС

Рис. 3. Значение показателей ВСС и ЖСС изолятов белка рапса, нута, сои Shansong-90 и гороха «Уралхим»

The value of BCC and HCC indicators of protein isolates of rapeseed, chickpeas, soy Shansong-90 and Uralchem peas

ЖСС изолята белка гороха имеет максимальный показатель ((310 ± 15) %), он почти сопоставим соевому (см. рис. 3). ЖСС изолята белка нута составил (195 ± 10) %, рапса – (155 ± 8) %. В работе Jacobson et al. (2023) показатель ЖСС для нута составил 170 %, для рапса – 280 % [31].

Жироэмульгирующие свойства изолятов нута и рапса составили (72 ± 4) и (64 ± 3) % соответственно (рис. 4). Для изолята гороха показатель ЖЭС составил (68 ± 3) %. Образец Shansong-90 имеет значение ЖЭС (62 ± 3) %, что на 2 % меньше в сравнении с изолятом рапса и на 23 % меньше, чем для изолята нута. Для растительных изолятов белка данный показатель составляет в среднем около 50 % [31]. Наибольшая стабильность эмульсии отмечена у изолята нута – (95 ± 5) %. Образцы изолята белка рапса, сои и гороха имеют сопоставимые значения стабильность эмульсии – около 90 %. В обзоре A. Moure и др. (2006) для белков рапса жироэмульгирующие свойства и стабильность эмульсии варьируется от 28,3 до 54 % и от 5 до 71 %, соответственно, полученные данные согласуются с литературными [32].

Пенообразующая способность пищевых добавок высоко ценится в таких продуктах, как соусы и заправки [33]. Данный показатель для изолята белка нута составил (70 ± 3) %, а для рапса – (45 ± 2) % (рис. 5). В работе Jakobson et al. (2023) пенообразующая способность образца нута и рапса составила 62 и 68 % соответственно [31]. Также для изолята белка рапса установлена достаточно низкая стабильность пены – (20 ± 1) %, в то время как для нута данный показатель составляет (47 ± 2) %. В зависимости от способа экстракции и изоляции для белков рапса значения пенообразующей способности и стабильности пены составляют от 43,3 до 211 % и от 8,2 до 74,7 % соответственно [34].

Изолят белка Изолят белка нута Изолят белка сои Изолят белка рапса                         «Shansong-90»  гороха «Уралхим»

• ■    ЖЭС ■ СЭ

Рис. 4. Значение показателей ЖЭС и СЭ изолятов белка рапса, нута, сои (Shansong-90) и гороха «Уралхим»

The value of HES and SE protein isolates of rapeseed, chickpeas, soybeans (Shansong-90) and Uralchem peas

Модификация функционально-технологических свойств полученных изолятов белка может быть достигнута за счет использования протеолитических ферментных препаратов [35]. В исследовании Chabanon et al. (2007) сообщалось об улучшении растворимости белка, водо- и жиросвязывающей способностей, увеличении жироэмульгирующих свойств и пенообразующей способности изолята белка рапса, обработанно- го ферментным препаратом Alcalase 2.4L [36]. Ферментативная обработка изолята белка нута протеазами приводит к увеличению показателей растворимости белка, ВСС, жироэмульгирующих свойств, стабильности эмульсии и пенообразующих свойств [37]. При этом отмечалось ухудшение стабильности пены и жиросвязывающей способности.

Изолят белка сои

Изолят белка гороха

Изолят белка рапса     Изолят белка нута

«Shansong-90»

«Уралхим»

■ ПС ■ СП

Рис. 5. Значение показателей ПС и СП изолятов белка рапса, нута, сои Shansong-90 и гороха «Уралхим»

The value of PS and SP indicators of protein isolates of rapeseed, chickpeas, soy Shansong-90 and Uralchem peas

Заключение. Полученные результаты позволяют рассматривать изоляты белка нута и рапса в качестве белкового пищевого ингредиента. На основе проведенного исследования установлено, что изоляты нута и рапса обладают схожими функционально-технологическими свойствами. При этом полученные изоляты обладают низкой растворимостью, относительно высокой водосвязывающей и низкой жиросвязывающей способностями, пенообразующей способностью и стабильностью пены. Биологическая ценность белков нута и рапса выше, чем у сои. Для восполнения белкового дефицита в рационе пита- ния человека изоляты рапса и нута могут быть использованы для разработки новых продуктов питания.

Дальнейшие исследования будут сосредоточены на определении путей модификации функционально-технологических свойств полученных изолятов белка посредством направленного протеолиза, что дополнительно позволит обогатить их биологически активными пептидами, образующимися в ходе деструкции белка, а также расширить область применения белковых препаратов рапса и нута в пищевой промышленности.