Сравнительная характеристика нефтедеградирующих свойств биопрепаратов микробного происхождения

• ^а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

• ^ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

В модельном почвенном эксперименте изучены нефтедеградирующие свойства биодеструктора нефти Fyre-Zyme производства американской компании Ecology Technologies International Inc. и биопрепарата на основе ЯЛо«/ососсгм-биосурфактантов, разработанного в лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Установлено, что препарат Fyre-Zyme в рекомендованной концентрации 6,0 вес. % ускоряет процесс биодеградации сырой нефти в модельной почве лишь на 10%. Обоснована целесообразность использования биопрепарата на основе Rhodococcus-еурфактангов, обеспечивающего 70%-ное разложение нефти и нефтепродуктов в почве, в технологиях очистки нефтезагрязненной почвы в условиях Уральского региона.

Одной из актуальных экологических проблем, возникающих в процессе интенсивного развития топливно-энергетической промышленности, транспорта и нефтедобычи, является накопление и миграция в окружающей среде ксенобиотиков, среди которых большую долю занимают нефтяные углеводороды. Углеводородные компоненты нефти являются высокотоксичными для почвенных биоценозов, ухудшают агрофизические и агрохимические показатели почвы, делая ее непригодной для ведения сельского хозяйства. В связи с этим потребность в технологиях, направленных на устранение последствий углеводородных загрязнений, трудно переоценить. В последние годы все большее внимание уделяется способам биологической очистки нефтезагрязненных земель как экологически безопасным. Биологические методы разрушения углеводородов применяют в тех случаях, когда их количество слишком мало, чтобы использовать механические средства сбора сырой нефти, но слишком велико, чтобы использовать загрязненные земли в хозяйственных целях (Коронелли и др., 1994; Atlas, 1981; Atlas, Bartha, 1992). В почвах с таким уровнем загрязнения содержание углеводородов достигает 5% веса почвы. Биоремедиация нефтезагрязненной почвы основана на использовании ферментативной активности углеводородо-кисляющих микроорганизмов. Известны два пути биодеградации углеводородов в воде и почве: 1 -интродукция в загрязненную экосистему микроорганизмов-деструкторов различных классов углеводородных загрязнений; 2 - активизация абориген ной нефтеокисляющей микрофлоры путем создания оптимальных условий для ее развития, в частности рыхление, внесение минеральных удобрений, органического материала, использование дренажных систем (Коронелли, 1996).

Для очистки почвы от нефтяных загрязнений в настоящее время биотехнологическими компаниями Европы и США предлагаются микробные препараты, так называемые бактериальные коктейли. Однако, как свидетельствует практика, применение зарубежных бактериальных нефтеокисляющих препаратов, разработанных для районов, резко отличающихся по климатическим и экологическим условиям от нашего региона, часто оказывается малоэффективным. Более того, неконтролируемое внесение в открытые экосистемы искусственных микробных популяций, зачастую неизвестного состава, может представлять значительную опасность как для почвенных биоценозов, так и для людей, занятых в технологическом процессе.

В этой связи разработка и применение конкретной технологии биоремедиации должны осуществляться с учетом характерных для Уральского региона эколого-климатических факторов, сопровождаться детальным структурным анализом углеводородного загрязнения, обязательным микробиологическим контролем и объективной оценкой биологической способности почвы к самоочищению.

Важно заметить, что в климатической зоне Уральского региона, где теплый период года непродолжителен, естественные процессы самоочищения и восстановления нефтезагрязненных почв проте-

кают медленно. Поэтому для Уральского региона особенно актуальна рекультивация с использованием технологий биоремедиации. Оптимальное сочетание агротехнических мероприятий позволяет снизить уровень загрязнения на 30-40% в основном за счет окисления легко деградируемых компонентов нефти (Christof! et al., 1998). При этом высокомолекулярные парафины, ароматические и полициклические соединения не разрушаются в течение ряда лет. Данные соединения прочно связываются с почвенными частицами, образуя гидрофобные пленки, и становятся практически недоступными для ферментных систем микроорганизмов. Для повышения биодоступности углеводородных поллютантов используют поверхностно-активные вещества (сурфактанты), которые способствуют десорбции и солюбилизации нефтяных углеводородов, тем самым облегчая их ассимиляцию микробными клетками. Однако повсеместно применяемые для борьбы с углеводородными загрязнениями синтетические сурфактанты - это высокотоксичные вещества с низкой деградабельностью. Их широкое использование приводит к накоплению экологически опасных соединений в почве. Кроме того, получение синтетических сурфактантов осложнено высокой стоимостью исходного сырья и технологических процессов химического синтеза. В настоящее время интенсивно ведется поиск активных сурфактантов биогенного происхождения. Многочисленные исследования в этом направлении проводятся в США и Канаде (Singer, Finnerty, 1990; Jain et al, 1992; Miller, Zhang, 1997), Германии (Oberbremer et al., 1989; Siegmund, Wagner, 1991; Lang, Wagner, 1999; Yakimov et al., 1998). В России работы по использованию биосурфактантов в процессах биоремедиации немногочисленны и ограничены в основном лабораторными экспериментами (Елисеев и др., 1991; Шульга и др., 1993;Коронеллиидр. 1994).

В лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (ИЭГМ УрО РАН) получены высокоэффективные и экологически безопасные биогенные сурфактанты, продуцируемые штаммами алканотрофных родококков, выделенных из природных источников нефтепромысловых районов Пермской области. Эти биосурфактанты имеют существенные преимущества перед синтетическими, как то: легкая биодеградабельность, устойчивая активность в экстремальных внешних условиях, оптимальные функциональные характеристики и возможность получения из нетрадиционных и относительно дешевых источников сырья.

Цель настоящей работы — сравнительный анализ способности биодеструктора нефти Fyre-Zyme и биопрепарата на основе Rhodococcus- биосурфактантов стимулировать процесс биодеградации нефти в условиях модельного почвенного эксперимента.

Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования служили биодеструктор Fyre-Zyme, созданный на основе метаболитов микроорганизмов, и, согласно Рекламному проспекту компании Ecology Technologies International Inc., представляющий собой экологически безопасный, нетоксичный, быстродействующий, эффективный, экономичный и удобный в использовании препарат для очистки воды и почвы от химических и нефтехимических загрязнений. Препарат Fyre-Zyme сертифицирован Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации и соответствует требованиям экологической безопасности. Он биодеградабе-лен и поэтому не вызывает вторичного загрязнения экосистемы (Рекламный проспект..., 1997).

В сравнительных исследованиях использовали биопрепарат на основе ЯАой?ососси$-биосурфактан-тов, разработанный в лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН и защищенный патентом на изобретение РФ № 2193464 (Приоритет от 04.11.2001). Используемые в биопрепарате биосурфактанты снижают поверхностное и межфазное натяжение воды до 26,8 и 0,9 мН/м соответственно, нетоксичны и экологически безопасны (Ившина и др., 1993; 1996; Куюкина и др., 1996; Ivshina et al., 1998; Kuyukina et al., 2003).

При постановке модельного эксперимента использовали почву (песок - 40%, глина - 40%, чернозем - 20%; pH 5,8). Опыты проводили в вакуумных эксикаторах емкостью 7 дм3, которые заполняли модельной почвой (V=5 дм3). Сырую нефть (уд. плотность 0,905 г/см3) с Чураковского нефтяного месторождения Пермской области вносили в почву в количестве 1,0 и 4,5 вес. %. В модельную почву еженедельно вносили 6,0%-ный водный раствор препарата Fyre-Zyme и 0,2%-ный водный раствор биопрепарата на основе Rhodococcus-биоеур-фактантов. На протяжении 5 недель проводили ежедневное рыхление почвы и увлажнение до достижения уровня относительной влажности 20%. Отбор почвенных образцов для аналитического и бактериологического анализа осуществляли еженедельно в соответствии с «Инструктивными указаниями по проведению газобиохимических и нефтегазопоисковых работ» (1974). Общее число клеток микроорганизмов в почве подсчитывали люминесцентным методом, просматривая окрашенные акридиновым оранжевым препараты в люминесцентный микроскоп марки «ЛЮМАМ И-2». С целью максимальной десорбции микроорганизмов с поверхности почвенных частиц осуществляли предварительную подготовку образцов, включающую ультразвуковую обработку почвенных суспензий на низкочастотном диспергаторе типа УЗДН-1 (2-3 мин) (Ившина, Куюкина, 1997). Количественный учет аэробных гетеротрофных бактерий проводили традиционным методом высева на питательный агар. Численность углеводород-разрушителей определяли путем их подсчета на чашках Петри с агаризованной минерально-солевой средой, а также с помощью непрямого метода иммунофлуоресцирующих антител (Ившина и др., 1987). В качестве источника углерода использовали смесь и-алканов C12-Ci7. Инкубирование проводили в течение 7 сут при 28°С. Все эксперименты осуществляли в трех повторностях. Общее содержание нефтепродуктов и неполярной углеводородной фракции (алифатических углеводородов) в образцах нефтезагрязненной почвы определяли весовым методом по количеству углеводородной фракции, выделенной хлороформенной и гексановой экстракцией (ОСТ 41-93, 1993). Физикохимические параметры исследуемой почвы (размеры почвенных частиц, температуру, влажность, влагоемкость и pH) измеряли по стандартным методикам (Вадюнина, Корчагина, 1975).

Математическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ Statistica (версия 6,0 для Windows). Для построения графиков и диаграмм использовали программу EXCEL 2002. Основной массив экспериментальных данных обрабатывали с помощью программ описательной статистики с вычислением среднего квадратического отклонения, стандартной ошибки, доверительного интервала. При оценке степени достоверности различий средних данных использовали t - критерий Стьюдента. Расчеты вели с учетом числа степеней свободы (Лакин, 1990). ■ '

Результаты и обсуждение

Как видно из табл. 1, в модельной почве присутствует значительное (2,63x107 клеток/г) число гетеротрофных бактерий. Численность углеводородо-кисляющих бактерий (УОБ) также высока (7,8x106 клеток/г), что указывает на потенциальную способность аборигенной микрофлоры к восстановлению нефтезагрязненной почвы. Следует отметить, что на протяжении всего эксперимента численность гетеротрофов и УОБ в почве, не подверженной загрязнению, сохраняется на уровне 106-107 клеток/г почвы. После внесения (4,5 вес. %) сырой нефти количество гетеротрофных бактерий в почве снижается до 2,0x106 клеток/г, тогда как численность УОБ остается практически на прежнем уровне - 7,4x105 клеток/г почвы. Таким образом, внесение сырой нефти оказывает ингибирующее действие на развитие гетеротрофных микроорганизмов и не влияет на жизнедеятельность углеводородокислителей. В результате рыхления и увлажнения нефтезагрязненной почвы наблюдается постепенное увеличение численности исследуемых групп микроорганизмов, коррелирующее с уменьшением содержания остаточной нефти (табл. 2).

Таблица 1

Результаты микробиологического анализа .         почвенных образцов

Характеристика образца	Дата отбора	Численность бактерий, клеток/г почвы
		гетеротрофных	углеводород-окисляющих
Контроль-	05.10.2001	(2,63 ± 0,30) х 107	(7,80 ± 2,00) х 105
ная почва	10.11.2001	(4,70 ± 1,32) х 108	(7,30 ± 2,98) х 106
Контроль	12.10.2001	(2,00 ± 0,02) х 10е	(7,40 ± 1,20) х 106
+ нефть	19.10.2001	(4,30 ± 0,11) х 106	(8,10 ± 0,40) х 106
(4,5 вес.	26.10.2001	(9,10 ± 0,10) х 106	(9,90 ± 1,00) х 106
%)	02.11.2001	(3,40 ± 0,50) х 107	(1,00 ± 0,30) х 107
	10.11.2001	(4,20 ± 0,12) х 107	(5,80 ± 1,40) х 107
Нефть (4,5	12.10.2001	(2,18 ± 0,11) х 106	(9,30 ± 1,50) х 106
вес. %) +	19.10.2001	(6,80 ± 0,51) х 106	(9,80 ± 0,40) х 106
Fyre-Zyme	26.10.2001	(1,00 ± 0,21) х 107	(3,30 ± 0,80) х 107
	02.11.2001	(3,80 ± 0,60) х 107	(6,80 ± 0,22) х 107
	10.11.2001	(5,10 ± 0,43) х 107	(8,30 ± 0,70) х 107
Нефть (4,5	12.10.2001	(2,30 ± 0,67) х 106	(6,50 ± 2,04) х 106
вес. %) + Rhodococ- cus-сурфак-	19.10.2001	(1,10 ± 0,17) х 107	(1,50 ± 0,30) х 107
	26.10.2001 02.11.2001	(8,30 ± 1,03) х 107 (1,80 ± 0,18) х 10*	(9,60 ± 0,61) х 10’ (1,40 ± 1,04) х 108
	10.11.2001	(6,40 ± 1,98) х 10"	(2,20 ± 0,41) х 108
Контроль	23.11.2001	(1,30 ± 0,10) х 107	(1,30± 0,41) х 107
+ нефть	30.11.2001	(4,80 ± 0,30) х 107	(5,30 ± 0,50) х 107
(1,0 вес.	07.12.2001	(5,00 ± 0,20) х 107	(8,60 ± 0,30) х 107
%)	15.12.2001	(9,00 ±0,60) х107	(1,20 ± 0,70) х 108
	21.12.2001	(8,20 ± 0,10)х 10*	(5,00 ± 0,30) х 108
Нефть (1,0	12.10.2001	(2,28 ± 0,70) х 107	(2,00 ± 0,80) х 1 О'
вес. %) +	19.10.2001	(3,50 ± 0,11) х 107	(4,68 ± 0,75) х 107
Fyre-Zyme	26.10.2001	(5,00 ± 0,20) х 107	(1,40 ± 0,20) х 108
	02.11.2001	(9,00 ± 0,12) х 107	(3,60 ± 0,10) х 108
	10.11.2001	(1,00 ± 0,30) х 108	(1,80 ±0,20) х 108
Нефть (1,0	12.10.2001	(6,20 ± 0,04) х 107	(1,50 ± 0,33) х 107
вес. %) +	19.10.2001	(9,70 ± 0,11) х 107	(1,20 ± 0,17) х 108
Rhodococ-	26.10.2001	(1,20 ± 1,65) х 108	(4,00 ± 0,24) х 108
cus-сурфак-	02.11.2001	(4,20 ± 1,10) х 108	(5,50 ± 1,12) х 10е
такты	10.11.2001	(5,60 ± 2,10) х 108	(4,00 ± 0,17) х 108

Примечание. Здесь и в табл. 2 приведены средние данные трех параллельных определений.

Продолжительность биоремедиации,сут.

Рис. 1. Интенсивность процесса биодеградации сырой нефти в модельной почве:

• 1    - нефтезагрязненная (4,5 вес. %) почва; 2 - нефтезагрязненная (4,5 вес. %) почва + Fyre-Zyme; 3 - нефтезагрязненная (4,5 вес. %) почва + Rhodococcus- сурфактанты; 4 - нефтезагрязненная (1,0 вес. %) почва;

• 5    - нефтезагрязненная (1,0 вес. %) почва + Fyre-Zyme; 6 - нефтезагрязненная (1,0 вес. %) почва + Rhodococ cMs-сурфактанты

Таблица 2

Результаты определения остаточной нефти (в вес. %) в почвенных образцах

Характеристика образца	Дата отбора	Остаточная нефть	Неполярная фракция
Нефтезагряз-	12.10.2001	4,50	2,84
ненная почва	19.10.2001	3,20	2,80
(4,5 вес. %) без	26.10.2001	3,44	2,72
внесения пре-	02.11.2001	3,43	2,58
	10.11.2001	3,40	2,28
парата	16.11.2001	3,50	2,16
Нефтезагряз-	12.10.2001	4,50	2,84
ненная почва	19.10.2001	3,78	2,72
(4,5 вес. %) +	26.10.2001	3,54	2.52
«Fyre-Zyme»	02.11.2001 10.11.2001	3,15 3,09	2,42 2,22
	16.11.2001	3,09	2,16
Нефтезагрязне	12.10.2001	4,56	2,36
иная почва (4,5	19.10.2001	2,95	2,20
вес. %)	26.10.2001	2,56	2,08
+Rhodococcus-	02.11.2001	2,55	1,68
сурфактанты	10.11.2001 16.11.2001	2,60 2,24	1,41 1,07
Нефтезагряз-	12.10.2001	1,00	0,64
ненная почва	19.10.2001	0,98	0,60
(1,0 вес. %) без	26.10.2001	0,78	0,57
внесения пре-	02.11.2001	0,60	0,53
	10.11.2001	0,58	0,44
парата	16.11.2001	0,54	0,36
Нефтезагряз-	12.10.2001	1,00	0,66
ненная почва	19.10.2001	0,90	0,56
(1,0 вес. %) +	26.10.2001	0,66	0,48
«Fyre-Zyme»	02.11.2001 10.11.2001	0,56 0,52	0,24 0,20
	16.11.2001	0,54	0,18
Нефтезагряз-	12.10.2001	1,20	0,67
ненная почва	19.10.2001	0,70	0,50
(1,0 вес. %) +	26.10.2001	0,62	0,45 .
Rhodococcus-	02.11.2001	0,50	0,30
	10.11.2001	0,45	0,2
сурфактанты	16.11.2001	0,37	0,11

Внесение в модельную почву сырой нефти в концентрации 1,0 вес. % оказывает стимулирующий эффект на развитие углеводородокисляющих и, в меньшей степени, гетеротрофных бактерий. Так, в почве, содержащей 1,0 % сырой нефти, численность углеводородокисляющих бактерий уже к концу второй недели эксперимента достигает 5,3x107 клеток/г. Аналогичная численность микроорганизмов отмечается в результате внесения 4,5% нефти только после 4-недельного срока эксперимента (см. табл. 1).

Как видно из рис. 1, препарат Fyre-Zyme не оказывает выраженного стимулирующего воздействия на жизнедеятельность исследуемых групп почвенных микроорганизмов. Так, выявлено лишь 10%-ное ускорение процесса биодеградации нефти, по сравнению с таковым в контрольной почве. Внесение биопрепарата на основе Rhodococcus-биосурфактантов существенно стимулирует развитие почвенной микрофлоры (см. табл. 1). В частности, уже через неделю после внесения биопре парата численность исследуемых групп бактерий в почве увеличивается на один порядок. Быстрое формирование углеводородокисляющего бактериоценоза в данном случае коррелирует с высокой скоростью биодеструкции нефти в почве с первоначальным содержанием нефтепродуктов 1,0 и 4,5 вес. %. При этом степень деградации нефти составляет 69,2 и 46,0% соответственно, что почти в два раза выше таковой в контрольной и обработанной препаратом Fyre-Zyme почве (см. рис. 1).

На рис. 2 показана динамика изменения содержания неполярной фракции нефтепродуктов в исследуемой почве. Степень деградации алифатических углеводородов в вариантах опыта с внесением Rhodococcus-биосур^актантов составляет в зависимости от первоначального уровня загрязнения (1,0 или 4, 5 вес. %) 83,6 и 74,5 % соответственно и значительно превышает контрольные показатели и результаты, полученные с использованием препарата Fyre-Zyme.

Варианты опыта

Рис. 2. Динамика изменения фракционного состава сырой нефти в модельной почве:

1 - исходная нефтезагрязненная (4,5 вес. %) почва;

2 - нефтезагрязненная (4,5 вес. %) почва + рыхление и увлажление; 3 - нефтезагрязненная (4,5 вес. %) почва + Fyre-Zyme; 4 - нефтезагрязненная (4,5 вес. %) почва + Яйос/ососсил-сурфактанты; 5 - исходная нефтезагрязненная (1,0 вес. %) почва; б -нефтезагрязненная (1,0 вес. %) почва + рыхление и увлажление; 7 - нефтезагрязненная (1,0 вес. %)

Выводы

• 1.    Препарат Fyre-Zyme - биодеструктор нефти, разработанный американской корпорацией Ecology Technologies International Inc., в рекомендованной концентрации (6,0%) неэффективен для биоремедиации почвы, загрязненной сырой нефтью.

• 2.    Биопрепарат на основе Rhodococcus- биосурфактантов, разработанный в лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, обеспечивает высокую эффективность процесса биодеградации нефти в модельной почве. При этом степень очистки нефтезагрязненной почвы через 5 недель эксперимента составляет 46,0 и

• 69,2% в зависимости от первоначального (4,5 и 1,0 вес. %) уровня загрязнения, соответственно.

• 3.    Биопрепарат на основе Rhodococcus- сурфактантов, обеспечивающий эффективное разложение нефти и нефтепродуктов в почве, рекомендуется для использования в технологиях очистки нефтезагрязненных почв в условиях Уральского региона.