Сравнительная характеристика семени козлов-производителей в зависимости от метода его получения

Введение . Коза ( Capra hircus ) является одним из первых одомашненных видов животных, возможно, это связано с тем, что она отличаются высокой толерантностью к климату, нетребовательна к условиям содержания. Этот вид имеет комбинированную продуктивность, от коз получают молоко, мясо, пух, шерсть, перерабатывают шкуры и кожи. Их разведением занимаются в любых природных и климатических зонах, на разных формах хозяйственных деятельности: как в крупных, так и на малых фермах, в том числе и в приусадебном хозяйстве. Козоводство занимает важное место в животноводстве многих стран мира [1].

Козы по сравнению с другими видами домашних жвачных животных неприхотливы к корму, например: из 320 видов растений крупный рогатый скот потребляет только 100 видов, овцы – 160, а козы – 168. Козы отличаются высокой резистентностью, особенно к таким заболеваниям, как туберкулез и чесотка. Разведение коз имеет ряд экономических преимуществ, так как большинство культурных пород относительно скороспелые и многоплодные – от 100 маток получают более 150 козлят.

По данным ФАО, поголовье коз в мире увеличивается – за последнее 10 лет (с 2004 до 2014 г.) численность коз в мире увеличилась на 19,1 %. Рост численности происходит в основном в Австралии и Новой Зеландии.

В России уже 100 лет практикуют культурное козоводство, работают с чистопородными завозными животными, но никогда не уделяли серьёзного внимания этой отрасли животноводства. За анализируемый период поголовье коз в нашей стране снизилось на 11,4 %, аналогичная тенденция сохраняется и по производству продуктов козоводства [2,3]. Разведение коз, особенно молочных пород, с экономической точки зрения более привлекательно, особенно в условиях небольшого фермерского хозяйства [4]. В 2011 г. правительством Российской Федерации с целью возрождения отрасли была разработана и принята отраслевая целевая программа «Развитие овцеводства и козоводства в Российской Федерации на 2012–2014 гг. и на плановый период до 2020 г.».

Для реализации программы требуется увеличение поголовья коз, внедрение в отрасли новых технологий, методов разведения, в том числе и в области репродуктивной технологии, особенно искусственного осеменения. Важнейшей частью вспомогательной репродуктивной технологии является получение, оценка, криоконсервация и оттаивание спермы. Качество замороженно-оттаянного семени зависит от многочисленных факторов, в том числе от видовой особенности самцов и способа его получения. Семя козлов имеет видовую особенность, в его плазме содержится фермент, который вызывает коагуляцию желтка куриного яйца [5, 6]. Использование для криоконсервации семени криопротекторных сред, содержащих в составе куриный желток, оказывает отрицательное влияние на качество семени козлов. Фермент секрета куперовых желёз катализирует гидролиз лецитина, содержащегося в яичном желтке, до свободных жирных кислот и лизоле-цитина. В результате данной реакции образуются вещества, приводящие к увеличению проницаемости цитоплазматической мембраны, ускорению акросомной реакции и увеличению фрагментации ДНК в хроматине [7, 8].

Существует несколько способов сбора семени у козлов. Наиболее распространенным методом является получение спермы с помощью искусственной вагины при нахождении коз в состоянии охоты.

Альтернативой данного метода является получение эякулированного семени электростимуляцией [9]. Результаты исследования показывают, что качественные и количественные показатели эякулированного семени козлов значительно отличаются. Электростимуляция позволяет получить больший объем семени с меньшей концентрацией половых клеток в 1 мл [10]. По данным французских исследователей, электроэякуляция оказывает отрицательное влияние на сохранность сперматозоидов. Результаты научных исследований показали, что удаление семенной жидкости методом отмывки семени непосредственно после взятия оказывает положительное влияние на выживаемость сперматозоидов [11, 12].

В настоящее время существуют различные способы отмывки семени от семенной жидкости, различающиеся по ряду критериев.

В некоторых случаях (например, неожиданная гибель животных или производители представляют опасность с точки зрения техники безопасности), когда получение эякулята невозможно, а производитель представляет высокую генетическую ценность, лучшим альтернативным источником жизнеспособных фертильных сперматозоидов является хвостовой участок эпидидимиса. Результаты многочисленных исследований подтверждают возможность получения потомства с помощью искусственного осеменения эпидидимальным семенем у целого ряда видов млекопитающих [13–16].

Эпидидимальные сперматозоиды имеют некоторые отличия от эякулированных, например, у них часто встречаются цитоплазматические капельки, которые могут быть локализованы по всей длине средней части сперматозоида. Исследования отечественных и зарубежных ученых свидетельствуют, что эпидидимальные сперматозоиды, полученные из придатков семенников козлов после убоя животных, по основным показателям (подвижность, процент живых сперматозоидов и целостность акросом) до и после замораживания/оттаивания не уступали эякулированным и были пригодны для оплодотворения in vitro и для искусственного осеменения [17, 18].

Цель исследования . Сравнительная характеристика спермы козлов-производителей, полученной разными методами.

Задачи :

• -    получить сперму от самцов рода Capra разными методами;

• -    провести сравнительную характеристику качественных и количественных показателей

семени, полученного разными методами;

• -    изучить влияние криоконсервации на биологическую полноценность семени, полученного разными методами.

Материал и методы. Исследование проведено в лаборатории репродуктивной криобиологии ВИЖ им. Л.К. Эрнста. При выполнении работы была использована биоресурсная коллекция «Криобанк». В экспериментах использовали клинически здоровых животных в возрасте 12 месяцев и старше. Эякулированное семя получали методом искусственной вагины на коз в охоте и методом электроэякуляции от козлов-производителей зааненской породы (n=8) и гибридов (n=2) F 1 (сибирский козерог х зааненская порода). Эпидидимальное семя получали фистульным методом от производителей заанен-ской породы (n=3) и постмортально (n=2).

Подвижность и концентрацию сперматозоидов определяли с помощью СASAтехнологии с использованием «Зоосперм», разработанной фирмой «Видеотест» [19]. При определении концентрации сперматозоидов использовали камеру Маклера. Оценку состояния акросом проводили с помощью дифференциального окрашивания (Diff Quick набор). В окрашенных мазках подсчитывали количество сперматозоидов (не менее 100 сперматозоидов) и определяли процентное содержание сперматозоидов с интактными акросомами.

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью пакета программ «Microsoft Exсel».

Результаты исследования. В образцах, по-лученых в искусственную вагину на коз в охоте и путем электростимуляции, содержалась плаз- ма, в том числе и фермент, вызывавший коагу-ляциию яичного желтка. С целью удаления плазмы, следовательно и решения проблемы реакции коагуляции желтка, нами была предложена методика фильтрации свежеполученного семени через мембрану фильтра Cameo25AS с диаметром пор 0,45 мкм, задерживающую прохождение сперматозоидов. С мембраны фильтра сперматозоиды отмывали средой для разбавления семени.

Эякулированное семя получали с интервалом в 2 дня в течение месяца в сентябре. Эпидидимальное семя получали от фистульных производителей и постмортально. Фистулы бы- ли установлены в семяпровод, семя получали в стерильные пробирки. Постмортально семя получали из хвоста эпидидимиса, для этого его содержимое извлекали в синтетической среде (гомогенизация), с последующей фильтрацией для освобождения от клеточных примесей.

В качестве криопротекторной среды использовали модифицированную среду, в состав которой входили лактоза, яичный желток, глицерин, ДМСО, BSA, лимонная кислота (рН среды 7,05).

Была проведена сравнительная характеристика свежеполученного семени различными методами (табл.).

Сравнительная характеристика свежеполученного семени от козлов-производителей

Показатель	Методы получения
	Эякуляция при присутствии коз в охоте	Электроэякуляция	Фистульный	Постмортальный
Объем, мл	2,10±0,20	2,90±0,20	0,60±0,02	1,30±0,10
Концентрация,млрд/мл	2,30±0,10	1,80±0,10	6,78±0,40	7,13±0,80
Содержание сперматозоидов с ППД, %	84,00±2,90	80,20±3,72	71,20±2,11	68,30±3,32
Содержание сперматозоидов с интактными акросомами,%	95,40±2,80	90,30±2,53	90,20±1,92	88,6±3,73
Содержание аномальных сперматозоидов, %	5,8±0,30	7,30±0,61	15,80±2,10	17,32±1,72

Как видно из таблицы, в зависимости от метода получения качественные и количественные показатели семени козлов-производителей существенно различаются. Наивысшее качество от козлов-производителей получено в искусственную вагину на коз в охоте. В образцах, полученных по данному методу, содержание сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением составило 95,4 %, что больше на 5 %, чем методом электростимуляции, фистулой – 6,8 %. Сперматозоиды с патологической морфологией наиболее часто встречались при получении их постмортально из хвоста эпидидимиса. Этот показатель в образцах, полученных в искусственную вагину, в три раза меньше, чем при постмортальном методе. Наибольшая концентрация сперматозоидов в 1 мл установлена при получении спермы фистульным и постмортальным методами, а наименьшая – при электроэякуляции. Высокая концентрация сперматозоидов в образцах, по- лученных из эпидимиса (фистульный и постмортальный метод), приводит к снижению подвижности сперматозоидов, так как при такой концентрации происходит накопление молочной кислоты, которая и подавляет подвижность сперматозоидов.

Все образцы с использованием идентичной технологии и криопротектерной среды были криоконсервированы в открытых гранулах. Нами была проведена оценка качества заморо-женно-оттаянного семени, полученного разными методами. Как видно из рисунка 1, наивысшая активность замороженно-оттаянных сперматозоидов наблюдается в образцах, полученных фистульным методом (более 45% сперматозоидов имели прогрессивно-поступательное движение). В результате цикла замораживания-оттаивания значительное снижение активности наблюдалось в образцах, полученных методом электростимуляции: всего 37 % сперматозоидов имели прямолинейно-поступательное движение.

Эякуляция

Фистульный

Электроэякуляция

Постмортальное

Рис. 1. Сравнительная характеристика подвижности замороженно-оттаянных сперматозоидов

Мы провели сравнительный анализ влияния криоконсервации на состояние акросом и морфологию сперматозоидов в зависимости от метода получения.

Больше всего повреждений акросом наблюдалось в образцах, полученных постмортально из эпидидимиса, по сравнению с свежеполучен- ным семенем содержание сперматозоидов с интактной акросомой снизилось на 27 %. Высокий показатель сохранности акросом исследуемых сперматозоидов наблюдается в образцах, полученных методом эякуляции в вагину на коз в охоте (рис. 2).

Эякуляция

Фистульный

Электроэякуляция

Постмортальное

Рис. 2. Характеристика акросом и морфологии сперматозоидов козлов-производителей

в зависимости от

Частота встречаемости аномалии в морфологии сперматозоидов в образцах, полученных из эпидидимиса постмортально в результате цикла замораживания-оттаивания, увеличилось по сравнению с другими группами. Возможно, метода получения это является следствием того, что в образцах, полученных этим методом, содержится больше сперматозоидов, которые не закончили цикл созревания.

Выводы. Таким образом, результаты исследований свидетельствуют, что от производителей рода Capra можно получить биологически полноценное семя методом искусственной вагины, электростимуляции, а также эпидидимальное семя постмортально и фистульным методом. Наивысшего качества семя получается от производителей с использованием метода искусственной вагины: содержание сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением составило более 95 %. Сперматозоиды с патологической морфологией наиболее часто встречались в образцах, полученных постмор-тально из эпидидимиса. Электроэякуляции, фистульный и постмортальный методы можно использовать как альтернативный метод получения биологически полноценного семени.