Сравнительная экспрессия рекомбинантной фосфолипазы А2 в Komagataella phaffii в зависимости от модификации сигнального пептида альфа-фактора

Фосфолипазы А2 (РLА2) – одни из самых изученных фосфолипаз, представляют собой липолитические ферменты, катализирующие гидролиз ацильной связи sn-2 в молекуле гидрофосфолипида, что ведет к освобождению свободных жирных кислот и лизофосфолипидов [1]. В ряде работ у РLА2 доказаны антибактериальные [2], противовирусные [3–5], противопара-зитарные [6, 7], антитромбоцитарные [8], гипотензивные [8], противоопухолевые свойства [9]. Кроме того, РLА2 применяются в одном из важнейших этапов рафинирования масла – его гидратации [10]. Особое место РLА2 занимает в промышленном производстве майонеза при ферментативном гидролизе яичного лецитина до изолецитина. Это обеспечивает более высокую стойкость эмульсии и требуемые реологические характеристики майонеза [11, 12]. В настоящее время на рынке России представлено несколько коммерческих ферментных препаратов рекомбинантной ФЛА2: «Nagase» (Япония), нативный штамм-продуцент Streptomyces violaceoruber ; «Maxapal» (Нидерланды), ФЛА2 поджелудочной железы свиней, штамм-продуцент Aspergillus niger . Однако растущие потребности рынка в производстве продуктов питания требуют разработки новых суперпродуцентов РLА2.

Одним из наиболее перспективных продуцентов РLА2 считается представитель метило-трофных дрожжей Komagataella phaffii (ранее Pichia pastoris ). Вид характеризуется высокой скоростью роста, способностью к оптимальному гликозилированию рекомбинантных белков, наличием механизмов эффективной секреции продуцируемых ферментов в культуральную среду, низкой секрецией протеаз и других собственных белков в культуральную среду, наличием регулируемого AOX-промотора [13, 14].

Ранее Liu et. el. был получен штамм-продуцент рекомбинантной РLА2 на основе K. phaffii GS115 с продукцией РLА2 из St. Viola-ceoruber на уровне 34,7 ± 0,2 ед./мл [15], что выше, чем у прокариотических штаммов-продуцентов РLА2 St. violaceoruber (0,5 ед./мл) и Escherichia coli (0,2 ед./мл) [16], однако все же не является достаточным для рентабельного промышленного производства.

Существует целый ряд факторов, определяющих эффективность экспрессии гетерологичных белков, в частности, оптимизация нуклеотидной последовательности целевого гена и повышение его копийности в геноме, оптимизация промотора, выбор сигнального пептида для секретируемых белков [17]. Для секреции гетерологичных белков в K. phaffii наиболее эффективен пре-про-пептид α-фактора (α-MF).

В настоящее время α-MF является наиболее широко распространенным сигнальным пептидом для секреции рекомбинантных белков и именно с ним удаётся добиться высокой экспрессии. Для улучшения вывода белка в настоящее время используют также разные модификации α-MF, полученные в результате направленной эволюции аминокислотного состава, мутаций, объединения с другими лидерными белками и т. д. Одним из перспективных вариантов α-MF может быть синтетический mf4i, с которым удалось повысить экспрессию рекомбинантной фитазы более чем в 3 раза относительно нативного альфа-фактора.

Цель работы – сравнение экспрессии РLА2 в Komagataella phaffii X-33 при использовании нативного α-MF и модифицированного синтетического сигнального пептида α-MF mf4i.

Материалы и методы

Для работы использованы гены фосфолипазы А2 (Рlа2) из Streptomyces violaceoruber (патент на изобретение RU 26763210), и модифицированного сигнала α – MF mf4i (GeneBank, No АY145833.1). Ген Рlа2 оптимизирован для эффективной экспрессии в K. phaffii в соответствии с частотой встречаемости кодонов [18].

Последовательность гена фосфолипазы А2, в соответствии с патентом на изобретение RU 26763210:

GATCCAGCAGATAAACCTCAAGTTTT GGCATCATTCACCCAGACATCCGCATCAT CCCAGAACGCATGGTTGGCCGCTAACAGA AACCAATCTGCTTGGGCTGCTTACGAATTT GATTGGTCTACTGATTTGTGTACTCAAGCT CCAGATAACCCTTTTGGTTTCCCATTCAAC ACTGCTTGTGCTAGACATGATTTCGGTTAC AGAAACTATAAGGCTGCTGGTTCTTTTGAT GCTAACAAGTCCAGAATTGATTCTGCTTTC TATGAGGATATGAAGAGAGTCTGCACTGG TTATACCGGAGAGAAGAACACTGCCTGTA ATTCCACTGCCTGGACCTACTATCAAGCCG TAAAAATTTTTGGT.

Целевые последовательности синтезированы в компании «Евроген» (Россия) и заклонированы в составе ТЕ-вектора рUС57.

Далее рестрикционно-лигазным методом проводили вставку гена Рlа2 в состав векторов экспрессии рРIСZаlрhаА и рРIСZА (Invitrogen, USA). Для этого с плазмиды рUС57-Рlа2 амплифицировали фрагмент ДНК, соответствующий гену Рlа2, праймерами Рlа2 for 5’ – ATATGAATTCGCTCCAGCAGATAAACC-3’ и Рlа2 rev 5’ – ATATGTCGACTCAACCAAA AATCTTTACG-3’ на амплификаторе Т100 (BioRad, USA) с помощью полимеразы Phusion (NEB, England). Полученный фрагмент длиной 366 п.о. клонировали в состав векторов рРIСZаА и рРIСZА по сайтам ЕсоRI и NоtI. Продуктами лигирования трансформировали химически компетентные клетки Escherichia coli Xl10Gold (Stratagen, USA). Корректность нуклеотидной последовательности гена Рlа2 в составе полученных конструкций рРIСZаlрhаА-Рlа2 и рРIСZА-Рlа2 выросших на селективных средах с зеоцином (25 мкг/мл) была подтверждена картированием и секвенированием ДНК в компании Евроген (Россия).

Для сборки конструкции рРIСZmf4iА-рlа2 TA-вектор, содержащий часть гена mf4i, и полученную конструкцию рРIСZА-Рlа2, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции ВstВI и ХhоI (СибЭнзим, Россия). Очистку целевых фрагментов ДНК проводили в 1% агарозном геле с последующей элюцией набором CleanUp Mini (Евроген, Россия) и лигированием с использованием Т4 ДНК-лигазы (СибЭнзим, Россия). Продуктами лигирования трансформированы химически компетентные клетки E. coli Xl10Gold (Stratagen). Корректность нуклеотидной последовательности гена mf4i в составе полученной плазмиды рРIСZmf4iА-Рlа2 подтверждали секвенированием.

Генетическая трансформация K. phaffii . Далее собранные генетические конструкции рРIСZаА-Рlа2 и рРIСZmf4iА-Рlа2 использовали для генетической трансформации штамма K. phaffii X-33 (Invitrogen, USA). На каждую трансформацию использовали по 10 мкг плазмид рРIСZаlрhаА-Рlа2 и рРIСZmf4iА-Рlа2, линеаризованных по сайту ВstХI в области AOX-промотора. Трансформация линеаризованными плазмидами штамма K. phaffii X-33 осуществлялась согласно протоколу Invitrogen [19]. Отбор трансформантов проводился на среде YPD с зеоцином (250 мкг/мл). Экспрессионная кассета, интегрируемая в геном K. phaffii представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Карта вектора экспрессии рРIСZаlрhаА-Рlа2

Figure 1. Map of the рРIСZаlрhаА-Рlа2 expression vector

Экспрессия РLА2 в K. phaffii X-33 . Полученные в результате трансформации K. phaffii X-33 векторами рРIСZаlрhаА-Рlа2 и рРIСZmf4iА-Рlа2 клоны культивировали в колбах Эрленмейера объемом 100 мл, содержащих по 20 мл среде

YPGM. Культивирование осуществляли в орбитальном термошейкере (BioSan, Латвия) при + 30 °C, 250 об/мин. Каждые 24 часа в среду вносили 1% метанола от объема среды. После культивирования клетки осаждали центрифугированием при 4200 g в течение 5 мин. Супернатант отбирали и использовали для анализа активности фосфолипазы А2. Всего проанализировано по 30 клонов K. phaffii с каждым типом сигнала секреции.

Анализ активности РLА2 проводился с использованием кислотно-щелочного метода титрования [15]. Активность РLА2 определялась как количество фермента, требуемое для высвобождения 1 мкг свободной жирной кислоты [20].

Далее образцы культуральной жидкости анализировали методом SDS-электрофореза в 15% ПААГ, а также качественным методом путем нативного электрофореза с последующей инкубацией пластин геля в агаризованном лецитине. по Леммли.

Для определения удельной активности рекомбинантной РLА2 и ферментного препарата «Nagase» проводили очистку фермента на препаративном хроматографе BUCHI на колонке Bio-Rad UNОsрhеrе Q (5 мл). В качестве буфера использовался 40 мМ Трис (рН = 10), в качестве элюента 1 М хлорид натрия в 40 мМ Трис буфере (рН = 10). Оценку активности фосфолипазы А2 в элюате проводили методом кислотнощелочного титрования, содержание белка определяли по Бредфорду.

Результаты и обсуждение

Получены конструкции рРIСZаlрhаА-Рlа2 и рРIСZmf4iА-Рlа2, проверенные секвенированием на корректность вставки и отсутствие мутаций в генах фосфолипазы А2 и модифицированного сигнала секреции mf4i. Линеаризованными конструкциями проведены трансформации компетентных клеток K. phaffii X-33 . По 30 выросших на среде YPD c 250 мкг/мл зеоцина клонов с каждой конструкцией проиндуцированы при культивировании в жидкой питательной среде YPGM. Полученная культуральная жидкость от клонов проанализирована на наличие РLА2 методом гель-электрофореза в ПААГ (рисунок 2). Исходя из полученных данных, клоны с конструкциями рРIСZаlрhаА-Рlа2 и рРIСZmf4iА-Рlа2 продуцируют РLА2. Как и в работе Liu et. el. [18], нами установлено, что K. phaffii экспрессирует три формы РLА2 размером около 13 (А), 16 (В) и 20 (С) кДа. Лишь одна из них соответствует ожидаемому размеру целевой РLА2 в 13,6 кДа. Остальные, вероятно, являются гликозилированными вариантами фермента.

Рисунок 2. Электрофореграмма белков культуральной жидкости клонов с разными вариантами сигнала α-MF. 1–8 – клоны рРIСZаlрhаА-Рlа2; 9–16 – клоны рРIСZmf4i-Рlа2; АВС – формы фосфолипазы А2; М – маркер размера белка

Figure 2. Electrophoregram of proteins of the culture fluid of clones with different signal variants α-MF. 1–8-clones of рРIСZаlрhаА-Рlа2; 9–16-clones of рРIСZmf4i-Рlа2; ABC-forms of phospholipase А2; M-marker of protein size

При этом нативный электрофорез образцов культуральной жидкости с последующим качественным проявлением РLА2 в среде с лецитином показал наличие двух активных форм РLА2 у всех полученных клонов (рисунок 3). Таким образом, одна гликозилированная форма РLА2 является интактной.

Рисунок 3. Результат нативного электрофореза белков культуральной жидкости клонов с разными вариантами сигнала α-MF. 1–4 – клоны рРIСZаlрhаА-Рlа2; 5–7 – клоны рРIСZmf4i-Рlа2

Figure 3. The result of native electrophoresis of proteins of the culture fluid of clones with different signal variants α-MF. 1–4 – clones рРIСZаlрhаА-Рlа2; 5–7-clones рРIСZmf4i-Рlа2

Результаты определения фосфолипазной активности в культуральной жидкости скульти-вированных клонов K. phaffii с разными вариантами генетической конструкции приведены в таблице 1. Средний уровень экспрессии РLА2 под фактором mf4i достоверно не отличается от такового в случае нативного сигнала α – MF. Однако экспрессия единичных клонов K. phaffii оказалась выше при использовании модифицированного сигнала mf4i, что показано на рисунке 4.

12345678 ■ Активность фосфолипазы (клоны alpha-MF), ед/мл ■ Активность фосфолипазы (клоны mf4i), ед/мл

Рисунок 4. Активность фосфолипазы А2 в культуральной жидкости клонов с различными факторами секреции

Figure 4. Phospholipase А2 activity in the culture fluid of clones with different secretion factors

Таблица 1.

Активность фосфолипазы А2 в культуральной жидкости в зависимости от типа конструкции

Table 1.

Phospholipase А2 activity in the culture fluid, depending on the type of construction

Тип конструкции, трансформированной в K. Phaffii Type of construct transformed in K. phaffii	Средние значения активности РLА2 в культуральной жидкости, ед./мл Average values of РLА2 activity in culture liquid, units/mL	Максимальная активность РLА2 в культуральной жидкости клонов, ед./мл Maximum activity of РLА2 in culture liquid of clones, units/mL
рРIСZаlрhаА-Рlа2	44,7 ± 16,2	77,2
рРIСZmf4iА-Рlа2	59,3 ± 3,6	106,7

Далее была проведена хромотографическая очистка рекомбинантной РLА2 из культуральной жидкости клонов с разными вариантами генетической конструкции, а также ферментного препарата «Nagase». По нашим данным, удельная активность рекомбинантной РLА2, экспрессируемой различными клонами K. phaffii , достоверно не различается и составляет 4650 ед./мг. При этом удельная активность РLА2 из ферментного препарата «Nagase», экспрессируемого St. violaceoruber , составила 5220 ед./мг.

Таким образом, метилотрофные дрожжи K. phaffii вне зависимости от типа сигнала экспрессируют рекомбинантные РLА2 со схожей активностью, сопоставимой с нативным ферментом St. violaceoruber .

Заключение

В результате проведенных исследований показано, что в среднем достоверных отличий в экспрессии, удельной активности рекомбинантной РLА2 метилотрофными дрожжами K. phaffii X-33 при использовании нативного сигнала секреции α – MF и его модифицированного варианта mf4i не обнаружено. Однако использование фактора секреции mf4i позволяет получить более высокую продукцию РLА2 у отдельных клонов K. phaffii .

Модифицированный фактор секреции mf4i имеет более высокий потенциал для экспрессии различных ферментов, что позволяет рассматривать его как перспективный фактор секреции для создания коммерческих экспрессионных систем на основе K. phaffii для синтеза гетерологичных белков.