Сравнительная макроскопическая характеристика почек крыс при различных способах фиксации

Изучение макропрепаратов является неотъемлемой частью обучения студентов и слушателей медицинских, фармацевтических, биологических и сельскохозяйственных вузов на морфологических дисциплинах согласно рабочим программам в соответствие с ФГОС 3. Фиксирующий раствор, применяемый при консервации макропрепаратов и бальзамировании, должен отвечать ряду условий [4].

Во-первых, это обеспечение безопасности обучающихся при осуществлении образовательной деятельности. Согласно федеральному закону РФ «Об образовании в Российской Федерации» (№ 273-ФЗ от 29.12.2012, ст. 41, п. 8), «охрана безопасности обучающихся включает в себя: … 8) обеспечение безопасности обучающихся во время пребывания в организации, осуществляющей образовательную деятельность» [11].

Во-вторых, это сохранение прижизненных визуальных характеристик тканей макропрепарата, поскольку вскоре после наступления биологической смерти или удаления органов из организма появляются посмертные изменения [8]. Фиксатор необходим для предотвращения аутолиза и сохранения материала в нативном виде с целью последующего изучения [5].

Кроме того, при выборе фиксатора или бальзамирующего раствора желательно учитывать экономический аспект, т. е. оптимальное соотношение цены раствора с его низкой токсичностью и способностью вызывать минимальные макроскопические изменения в тканях при длительном хранении объектов [7].

Наиболее часто для сохранения макропрепаратов используются растворы на основе формалина [7], который относится ко 2-му классу опасности по ГОСТ 12.1.1007 – высокоопасные вещества.

В продаже в Российской Федерации имеется фиксирующая смесь «Альдофикс» на основе глиоксаля, отечественного производства, не содержащая формальдегида и относящаяся к 4-му классу опасности (вещества малоопасные), т. е. более безвредная в применении [10].

Однако информации о результатах влияния глиоксаля на морфологические параметры органов и тканей в процессе изготовления макропрепаратов при различных сроках фиксации и сравнительной характеристики макропрепаратов, изготовленных с применением других фиксаторов на основе формалина, в доступной научной литературе нами не обнаружено.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Сопоставление результатов качественного и количественного макроскопического исследования почек крыс при различных способах и длительности фиксации.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования были проведены на 12 образцах почек белых крыс линии Wistar [2, 9]. В качестве фиксирующего раствора были использованы смеси на основе нейтрального за-буференного формалина (Ф) и глиоксаля (А) (коммерческое название «Альдофикс»).

Почки продольным разрезом разделяли на 2 половины и проводили измерения поперечного и продольного диаметров. 6 образцов (1-я группа) были помещены в раствор 10 % формалина; 6 образцов (2-я группа) были помещены в раствор «Альдофикса», представляющего собой раствор глиоксаля (альдегида муравьиной кислоты).

Через 1, 3 и 10 суток образцы извлекали, исследовали их качественные (форму, характер поверхности и разреза, определяли изменение цвета и консистенции), количественные (измеряли продольный и поперечный диаметры почек) характеристики, производили фотосъёмку исследуемого биоматериала с заранее определённой освещенностью рабочего места с использованием фотоаппарата Nikon D3000 kit.

Затем образец помещали в марлевый мешочек, который в дальнейшем маркировали цветной нитью и погружали в соответствующий фиксатор.

Через трое суток была произведена перезаливка растворов. Образцы 1-й группы помещали в раствор, состоящий из 50 мл 10 % формалина, 25 мл 96 ° этилового спирта и 25 мл проточной воды.

Образцы 2-й группы помещали в раствор, состоящий из 50 мл альдофикса, 25 мл 96 ° этилового спирта, 25 мл проточной воды.

Полученные в ходе фотосъёмок изображения макропрепаратов открывали в программе Adobe Photoshop CS5, содержащей таблицу цветовой гаммы HSL [1, 3].

На цифровых фотографиях почек, выполненных через 1, 3 и 10 суток фиксации, определяли цифровые значения насыщенности в 6 различных участках, заносили данные в таблицу, проводили статистическую обработку с построением графика.

Полученные количественные данные были подвергнуты статистической обработке с использованием U-критерий Манна–Уитни [6].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При качественном изучении макропрепаратов почек крыс отмечалось прогрессивное изменение цвета поверхности и среза органа с приобретением серого оттенка. При этом более выраженные изменения были выявлены при фиксации альдофиксом уже после первых суток (рис. 1).

Таблица HSL представлена показателями: H – оттенок, S – насыщенность и L – свет.

Значения оттенка «H» повышались тем больше, чем больше обесцвечивались (серели) почки после воздействия на них фиксирующей смеси.

Свет «L» имел фиксированный показатель (L = 14), что достигалось путём сохранения одинаковых условий освещённости рабочего места при каждой фотосъёмке.

В данной методике мы пренебрегли значением насыщенности (S).

При проведении анализа с использованием таблицы цветовой гаммы, выявили, что на 1-е сутки оттенок почки, не подвергшейся влиянию фиксаторов, имел H = 5 [ДИ 3,7; 6,3] усл. ед. На 3-и сутки органы, фиксированные в растворе на основе глиоксаля, имели H = 42 [ДИ 41,07; 42,93] усл. ед., в растворе на основе формалина H = 31 [ДИ 29,7; 32,3] усл. ед. На 10-е сутки у почек, находившихся в глиоксале H = 50 [ДИ 47,7; 52,3] усл. ед., в формалине H = 40 [ДИ 38,8; 41,2] усл. ед.

Следовательно, значение показателя оттенка (H) у почек из формалина на 10-е сутки ниже на 20 %, по сравнению с показателем H почек из смеси содержащей глиоксаль (p < 0,05), что говорит о лучшей сохранности цвета под действием фиксатора на основе формалина (рис. 2), так как насыщенность цвета пропорционально уменьшается с повышением значения H (значения оттенка) в цветовой гамме.

Левая почка

Рис. 1. Качественный анализ цвета органов после фиксации

Рис. 2. Изменение H при различных методах фиксации

– различия достоверны относительно контрольной группы при p < 0,05 (использован непараметрический критерий Манна–Уитни;

тест Колмагорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса)

Изменение диаметра почек крыс при различных методах фиксации

Номер группы	Время исследования, в сут.
	1-е	3-и	10-е
Продольный диаметр, мм
1-я (Ф)	13,0 ± 0,26	12,8 ± 0,31	11,7 ± 0,21
2-я (А)	13,0 ± 0,26	11,2 ± 0,31*	8,8 ± 0,31*
Поперечный диаметр, мм
1-я (Ф)	9,2 ± 0,31	9,3 ± 0,21	8,0 ± 0,26
2-я (А)	9,2 ± 0,31	7,7 ± 0,21*	5,7 ± 0,21*

– p < 0,05 по сравнению с 1-й группой (двухфакторный дисперсионный анализ с постобработкой тестом Бонферрони).

Отмечено различие в значениях диаметров исследуемых органов различных групп. На 3-и сутки исследования продольный диаметр почек, фиксированных в растворе на основе глиоксаля, уменьшается на 12,5 % (p < 0,05) по сравнению с фиксацией в растворе на основе формалина. На 10-е сутки разница возросла до 24 % (p < 0,05).

Почки, находившиеся в альдофиксе, оказались более сморщенными и значительно меньше в сравнении с почками, фиксированными в растворе на основе формалина, что можно наблюдать на фотографии представляющей две изначально идентичные половины, различающиеся между собой после фиксации по форме и размеру (рис. 3).

Правая почка

Рис. 3. Изменение формы почек под воздействием различных фиксаторов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенного количественного макроскопического исследования с последующим статистическим анализом, установлено, что поперечный диаметр почки крысы под действием фиксирующего раствора на основе глиоксаля (2-я группа), на 3-и сутки исследования уменьшилcя на 17 % (p < 0,05), на 10-е сутки – на 28 % (p < 0,05) по сравнению с почками, находившимися в фиксаторе на основе формалина (1-я группа).

Продольный диаметр почки крысы под действием фиксирующего раствора на основе глиоксаля (2-я группа) на 3-и сутки исследования уменьшился 12,5 % (p < 0,05) по сравнению с фиксацией в растворе на основе формалина (1-я группа). На 10-е сутки разница возросла до 24 % (p < 0,05).

Анализ изменения цвета, проведённый в таблице цветовой гаммы HSL, и последующая статистическая обработка показали, что более эффективную сохранность цветового оттенка органов обеспечивает фиксация в растворе на основе формалина, о чём свидетельствуют полученные в ходе исследований данные.

Почки, фиксированные в формалине, имели числовое значение оттенка (H) на 10-е сутки ниже на 20 % (p < 0,05) по сравнению с органами, фиксированными в глиоксале.

Проведённые исследования демонстрируют большую сохранность качественных и количественных макроскопических параметров почек крыс под воздействием различных сроков экспозиции в фиксирующем растворе на основе формалина по сравнению с использованием менее токсичного фиксатора на основе глиоксаля.

Является перспективным продолжение поиска новых фиксаторов, обладающих меньшей токсичностью, что соответствует закону РФ (Ф3 № 273) «Об образовании в Российской Федерации», но обеспечивающих лучшую сохранность органов и тканей при бальзамировании.