Сравнительная оценка изолированного влияния физических и химических факторов на относительную длину теломер лабораторных животных в модельных условиях

Оценка влияния физических и химических факторов производственной среды на изменение относительной длины теломер (ОДТ) у работающих является одним из перспективных направлений в современных условиях и может служить маркером не только старения, но и интенсивности окислительного стрес- са и хронического воспаления. Моделирование данных воздействий в экспериментах на лабораторных мышах ICR и крысах Wistar расширяет наши познания в данном направлении [1].

Хроническое воздействие физических [2] и химических [3] производственных факторов (стрессо-

Савченко Олег Андреевич – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: ; тел.: 8 (383) 343-44-43; ORCID: .

Новикова Ирина Игоревна – доктор медицинских наук, профессор, директор (e-mail: ; тел.: 8 (383) 343-34-01; ORCID: .

Савченко Ольга Анатольевна – кандидат медицинских наук, доцент кафедры педиатрии с курсом ПДО (e-mail: ; тел.: 8 (381) 236-28-35; ORCID: .

ров) [4] на трудоспособное население может вызывать ухудшение здоровья, повышать риски развития различных заболеваний [5] и провоцировать ускоренное старение [6, 7].

Длительное воздействие стрессоров различной природы может провоцировать ускоренное биологические старение (укорочение длины теломер лейкоцитов) и хроническую гиперактивацию физиологических стрессовых систем организма [8]. Причем сочетанное воздействие физических и химических производственных стрессоров на производстве и в быту также способствует распространенности профессиональных заболеваний и ускоренного старения [9].

Исследование L.Y. Hao et al., 2005, показало, что тяжесть течения заболеваний напрямую связана с изменением длины теломер в сторону их укорочения, что проявляется снижением количества стволовых клеток в организме человека [10]. Это подтверждается и результатами других исследований, так, в трудах M. Shoeb et al. [11], определено, что ускоренное старение и заболеваемость населения тесно связано с длиной теломер. В ряде исследований ведущих зарубежных ученых [12, 13] показано, что укорочение ОДТ является биомаркером старения человека и имеет связь с развитием возрастных заболеваний почек [12], а также повышает риск заболеваний, связанных со снижением пролиферации клеток и дегенерацией тканей [13]. Однако на сегодняшнем этапе биомедицинских исследований по изучению изолированного периодического воздействия физических и химических факторов на изменение ОДТ широко используются модельные животные – мыши ICR и крысы Wistar [14, 15], способствующие изучению процессов и механизмов ускоренного старения.

Цель исследования – сравнительная оценка изолированного влияния физических и химических факторов на относительную длину теломер лабораторных животных в модельных условиях.

Материалы и методы. Исследование проводилось на лабораторных мышах ICR ( n = 65) и крысах Wistar ( n = 65) в течение 90 и 180 дней соответственно с учетом рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей¹, Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию (Вашингтон, 2011)².

В соответствии с дизайном эксперимента животных разделили на четыре группы, в каждую группу включено равное количество животных. Первая группа ( n = 15 + 15) являлась контрольной (животные, не подвергавшиеся воздействиям физических и химических факторов производственной среды).

На вторую группу животных ( n = 15 + 15) осуществлялось воздействие вибрацией по аналогии с технологической вибрацией на стационарных рабочих местах³: уровни виброускорения в октавных полосах со среднегеометрическими частотами: 1–63 Гц, OX – 57,3–100,2; OY – 51,4–101,5; OZ – 62,5–103,6 дБ; эквивалентный корректированный уровень виброускорения, дБ: OX – 98,6; OY – 99,9; OZ – 102,1 в течение 0,5 часа ежедневно.

В третьей группе ( n = 15 + 15) на животных воздействовали шумом 81,5–85,3 дБА в шумовой камере по 0,5 ч ежедневно. В четвертой группе лабораторных животных ( n = 15 + 15) подвергали химическому воздействию смесью углеводородов в 200 л в затравочной камере: диметилбензол (смесь 2-, 3-, 4-изомеров) – 225 мг/м³; бензин-растворитель, топливный – 225 мг/м³; метилбензол – 450 мг/м³; пропан-2-он – 1200 мг/м³ в концентрации 1,5 ПДК по 0,5 ч ежедневно.

Для фонового анализа в контрольные группы выделено по пять особей ( n = 5 + 5), которые размещались отдельно.

ОДТ определяли на 0-е, 30-е (60-е), 60-е (120-е) и 90-е (180-е) сутки эксперимента. ДНК из биологических образцов поперечнополосатой мышечной ткани бедра животных выделяли методом фенолхлороформной экстракции4 с помощью количественной ПЦР в реальном времени на основе методики R.S. Lee et al. [16] с модификациями В.Н. Максимова [17]. Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре Epoch для микропланшетов (BioTek Instruments, США).

В качестве однокопийного референсного гена был взят ген альбумина. Отдельные количественные реакции для теломер и гена альбумина ставили в парных 96-луночных плашках в идентичных позициях. Каждая плашка включала серию разведений ДНК (0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10; 20 и 30 нг), которые были использованы для создания калибровочной кривой и количественной оценки каждого образца.

Реакционная смесь для анализа теломер содержала следующие реагенты: 270 nM tel1b праймер

(5′ ACACTAAGGT-TTGGGTTTGG-GTTTGGGTTT-GGGTTAGTGT 3′), 900 nM tel2b праймер (5′ TGTTAGGTAT-CCCTATCCCT-ATCCCTATCC-CTATCCCTAACA-3′), 0,2X SYBR Green I, 5 mM DTT (ditriotreitol), 1 % DMSO (dimethylsulfoxide), 0,2 mM каждого dNTP, 1,5 mM MgCl2, 1,25 ед. DNA polymerase в конечном объеме 15 мкл буфера для ПЦР. Циклы ПЦР: 10 мин на 95 °C, затем 25 циклов 95 °C – 15 с, 54 °C – 30 с, 72 °C – 90 с. Реакционная смесь для анализа гена альбумина содержала следующие реагенты: 300 nM Albd праймер (5′ GCTGACTGCT-GTACAAAACA-AGAG-3′), Albr праймер (5′ TGACTATCAG-CATAAGTGTT-ACTA-3′), 0,2X SYBR Green I, 5 mM DTT (ditriotreitol), 1 % DMSO (dimethylsulfoxide), 0,2 mM каждого dNTP, 1,5 mM MgCl2, 1,25 ед. DNA polymerase в конечном объеме 15 мкл буфера. Циклы ПЦР: 95 °C – 3 мин, затем 35 циклов 95 °C – 15 с, 58 °C – 20 с, 72 °C – 20 с. Обе реакции ставили на амплификаторе QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США). Проводился контроль качества и расчет отношения T / S (теломеры к однокопийному гену). Если кривые амплификации образца в трех репликах имели стандартное отклонение > 0,5, то такой образец исключали из дальнейшего анализа [18].

Статистическая обработка результатов эксперимента выполнена в программе Statistica 10, использованы методы непараметрического анализа. Для оценки различий использован критерий Манна – Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался на уровне меньше 0,05.

Результаты и их обсуждение. Исследования на крысах Wistar являются продолжением ранее проведенного эксперимента на мышах ICR [18], что позволило провести сличимость и сопоставимость полученных повторно экспериментальных данных на основе процедуры биомеханического моделирования. Анализ ОДТ в образцах мышечной ткани бедра экспериментальных групп показал значимую связь между ОДТ и возрастом в течение 90 дней наблюдения у мышей линии ICR и 180 дней у крыс линии Wistar.

Также были выявлены различия в ОДТ между экспериментальными группами и контрольной. Например, у мышей ICR контрольной группы на 90-й день исследования ОДТ оказалась короче (0,33 [0,32; 0,35] отн. ед.), чем на 0-е сутки (0,84 [0,81; 0,93] отн. ед.). У крыс Wistar контрольной группы наблюдалась аналогичная картина укорочения ОДТ (таблица) на 180-е сутки (1,52 [1,48; 1,61] отн. ед.), по сравнению с 0-ми сутками (2,38 [1,92; 2,41] отн. ед.).

Сравнительная оценка изолированного воздействия физических факторов на ОДТ у мышей (группы 2 и 3) показала статистически достоверное укорочение ОДТ на 60-е (группы 2 и 3 (0,47 [0,38; 0,33] отн. ед.) и 90-е сутки (группы 2 и 3 (0,29 [0,28; 0,32] отн. ед.), по сравнению с контрольными данными на 60-е (0,62 [0,55; 0,76]) и на 90-е сутки (0,33 [0,32; 0,35]). В аналогичных условиях воздействия физического фактора на крыс наблюдалась схожая картина укорочения ОДТ на 120-е сутки в группе 2 (воздействие вибрации (1,11 [0,98; 1,27] отн. ед.)) и в группе 3 (воздействие шума 1,47 [0,96; 1,49] отн. ед.), а также на 180-е сутки (группа 2 (0,69 [0,62; 0,82] отн. ед.) и группа 3 (0,83 [0,77; 0,93] отн. ед.)), по сравнению с контрольными данными на 120-е (1,79 [1,66; 2,22]) и 180-е сутки (1,52 [1,48; 1,61]). Физические факторы негативно сказывались на функционировании центральной нервной системы (ЦНС) и мозжечка, что вызывало укорочение ОДТ и ускоренное старение биологических систем организма у животных опытных групп (у мышей на 60-е и 90-е сутки; у крыс на 120-е и 180-е сутки) по сравнению с контрольной группой.

Воздействие комплекса токсических веществ приводило к значительному укорочению ОДТ у мышей и крыс опытных групп, по сравнению с контрольными данными, и опытными группами, подверженными периодическому изолированному влиянию физических факторов (см. таблицу). Укорочение ОДТ у мышей наблюдалось на 30-е сутки (0,56 [0,56; 0,69]) и в последующем усиливалось на 60-е (0,37 [0,28; 0,41]) и 90-е сутки (0,25 [0,25; 0,35]), по сравнению с контрольными данными на

Сравнительные результаты изолированного влияния производственных факторов на ОДТ лабораторных мышей ICR [18] и крыс Wistar в модельных условиях, Me [ LQ ; HQ ]

Группа

n

30-е сут.

n

60-е сут.

n

90-е сут.

n

60-е сут.

n

120-е сут.

n

180-е сут.

ОДТ мышей ICR [18]

ОДТ крыс Wistar

Группа 1 (контроль)

5

0,79 [0,73; 0,81]

5

0,62 [0,55; 0,76]

5

0,33 [0,32; 0,35]*

5

1,84 [1,82; 2,38]

5

1,79 [1,66; 2,22]

5

1,52 [1,48; 1,61]*

Группа 2 (вибрация)

5

0,61 [0,61; 0,66]

5

0,47 [0,38; 0,55]*,#

5

0,29 [0,28; 0,32]*,#

5

1,79 [1,72; 2,31]

5

1,11 [0,98; 1,27]*,#

5

0,69 [0,62; 0,82]*,#

Группа 3 (шум)

5

0,61 [0,61; 0,66]

5

0,47 [0,38; 0,55]*,#

5

0,29 [0,28; 0,32]*,#

5

1,72 [1,51; 1,79]

5

1,47 [0,96; 1,49]*,#

5

0,83 [0,77; 0,93]*,#

Группа 4 (химия)

5

0,56 [0,56; 0,69]*

5

0,37 [0,28; 0,41]*

5

0,25 [0,25; 0,35]*

5

1,51 [1,39; 1,57]*

5

1,03 [1,01; 1,13]*

5

0,67 [0,67; 0,82]*

Примечание: приведены статистически значимые ( р < 0,05) отличия от величин соответствующих показателей: * – на 0-е сут., # – по сравнению с контрольными данными; также в таблице приведены сравнительные результаты ранее проведенного нами исследования на ОДТ мышей ICR [ 18 ] .

Рис. Изменение ОДТ ( а ) у мышей ICR [18] и ( б ) крыс Wistar, находившихся под периодическим изолированным воздействием физических и химических факторов

30-е (0,79 [0,73; 0,81]), 60-е (0,62 [0,55; 0,76]) и на 90-е сутки (0,33 [0,32; 0,35]) [18]. У крыс наблюдалась схожая картина укорочения ОДТ (см. таблицу) начиная с 60-х суток – 1,51 [1,39; 1,57], по сравнению с контрольными данными (1,84 [1,82; 2,38]), на 120-е сутки – 1,03 [1,01; 1,13], по сравнению с контрольными данными (1,79 [1,66; 2,22]), и на 180-е сутки – 0,67 [0,67; 0,82], по сравнению с контрольными данными (1,52 [1,48; 1,61]). Воздействие 4-компонентной смеси углеводородов на альвеолярно-капиллярную мембрану легких и обонятельную луковицу переднего мозга оказывало негативное влияние на ЦНС, вызывая также укорочение ОДТ и ускоренное старение у мышей и крыс опытных групп, по сравнению с соответствующими показателями контрольной группы.

Полученные в ходе экспериментов результаты (рисунок) на мышах ICR [18] показали их сличи-мость и сопоставимость с полученными повторно экспериментальными данными на крысах Wistar (% от значения ОДТ на 0-е сутки).

Наибольшие темпы укорочения ОДТ от воздействия химического фактора отмечались у мышей по истечении 30-х суток эксперимента, у крыс – 60-х суток эксперимента; по вибрации и шуму максимальный прирост отмечался у мышей на 60-е сутки эксперимента, у крыс – на 120-е. Различия показателей ОДТ в сравнении с исходным значением (% от значения ОДТ на 0-е сутки) утрачиваются у мышей на 90-е сутки эксперимента, а у крыс – на 180-е сутки воздействия физического и химического фактора, что можно интерпретировать как общее старение животных и повышение рисков у них воз- никновения хронических неинфекционных заболеваний (в виде доли от значения на 0-е сутки).

В доступной литературе нам не встретились работы, позволившие в полной мере оценить степень изолированного влияния физических и химических факторов в динамике их временного воздействия на ОДТ крыс Wistar. Исключение составили проведенное нами исследование на мышах линии ICR [ 18 ] и работы отдельных авторов [19-21], показывающие негативную роль воздействия стресса [19] на укорочение ОДТ [20], развитие клеточного старения у работников промышленных предприятий [21], непосредственно влияющего на качество и продолжительность жизни людей. В связи с этим мы провели серию субхронических и хронических экспериментов для получения сличимости результатов об эффектах изолированного периодического воздействия физических и химических факторов (на уровне 1,5 ПДК, ПДУ) на разных видах животных (мыши и крысы). Это позволило углубить наши познания в установлении рисков здоровью и процессах ускоренного старения в биологических системах теплокровных организмов.

Выводы. На основании проведенных исследований могут быть сделаны следующие выводы. Теломеры являются защитными концевыми участками хромосом и играют ключевую роль в поддержании стабильности генома и регуляции клеточного старения. Полученные авторами результаты могут рассматриваться как подтверждение гипотезы о том, что укорочение ОДТ у биологических объектов, длительно находящихся под воздействием физических и химических факторов производственной среды, свидетельствует о раннем клеточном старении. Вывод корреспондируется с ранее выполненными исследованиями, что длина теломер является маркером рисков развития возрастных заболеваний и заболеваний, связанных с профессией, в том числе сердечно-сосудистых (инфаркты, инсульты) [22]. Кроме того, изолированное периодическое воздействие физических и химических факторов (действующих на уровне 1,5 ПДК, ПДУ) в хроническом эксперименте на модельных животных провоцировало укорочение ОДТ [19], вызывало снижение двигательной, эмоциональной и исследовательской активности [1], а также провоцировало развитие морфологических изменений в двух и более внутренних органах (биомаркер ускоренного старения) у модельных животных с наиболее выраженными сосудистыми изменениями на 180-е сутки эксперимента и с начальными проявлениями на 60-е и 120-е сутки [23], что может свидетельствовать о запуске старения биологических систем и негативно влиять на сроки их жизни.

Наибольший эффект, способствующий укорочению ОДТ животных опытных групп, оказывало длительное химическое и вибрационное воздействие, по сравнению с данными группы контроля (интактные животные).

Наименьшее влияние на изменение ОДТ оказывало на начальном этапе шумовое воздействие у мышей и вибрационное воздействие у крыс, в дальнейшем у обоих видов минимальное влияние на ОДТ оказывало шумовое воздействие. Данные проявления могут свидетельствовать, что шум на начальном этапе не вызывает значительного повреждения ДНК или окислительного стресса, как общая вибрация и комплекс углеводородов. Однако, несмотря на более низкий уровень влияния, длительное шумовое воздействие также может являться пусковым механизмом развития патологии многих органов и систем [23] и иметь негативные последствия для здоровья всего организма в целом [24].

Изменения в ОДТ были наиболее выражены на 90-е сутки у мышей ICR и на 180-е сутки у крыс Wistar, находившихся под периодическим изолированным воздействием физических и химических факторов, что в пересчете на человека (1,3 недели жизни мыши соответствует одному году жизни человека; одна неделя жизни крысы соответствует одному году жизни человека) может свидетельствовать о негативном воздействии факторов производственной среды, начиная с 10–15 лет трудового стажа человека, причем начальное укорочение ОДТ [18] и изменения во внутренних органах животных начинают развиваться в период, соответствующий 5–9 годам трудового стажа человека [23].

Укорочение ОДТ у биологических объектов, находящихся длительное время в контакте с физическими и химическими факторами, свидетельствует об ускорении процессов старения биологических систем организма и может повышать риски развития сердечно-сосудистых и возрастных заболеваний. Полученные в эксперименте результаты свидетельствуют об ускорении клеточного старения у животных опытных групп по сравнению с контрольными данными, что также подтверждается появлением сосудистых нарушений во внутренних органах [23], снижением показателей ориентиро- вочно-исследовательского поведения и общими признаками ускоренного старения организма опытных животных [1].

Проведенное исследование подчеркивает важность снижения рисков развития ускоренного (клеточного) старения, сердечно-сосудистых заболеваний (инсультов и инфарктов) у биологических объектов, находящихся в условиях длительного негативного воздействия физического и химического факторов (на уровне 1,5 ПДК, ПДУ). Полученные результаты свидетельствуют о необходимости гигиенического контроля и качественной гигиенической оценки условий труда на рабочих местах, минимизации воздействия физических и химических факторов на работающих путем внедрения дополнительных профилактических мероприятий, перерывов, использования необходимых средств индивидуальной защиты (средства защиты глаз, кожи, органов дыхания: беруши, противогазы, респираторы, очки, перчатки защитные) и специальной одежды и обуви, а также проведения ультразвуковых исследований в ходе диспансеризации, направленных на раннюю диагностику заболеваний у работающих в условиях воздействия факторов производственной вредности для достижения целей трудового долголетия.

В дальнейшем планируется более глубокое изучение механизмов, через которые вышеприведенные факторы влияют на длину теломер и процессы ускоренного старения биологических систем организма.

Финансирование. Работа выполнена в рамках темы НИР «Изучение процессов клеточного старения и биологического возраста, работающих с различными факторами производственной вредности в управлении трудовым долголетием» (Рег. № АААА-А19-119070190016-3. Государственное задание № 141-00094-23-00 на 2023 г. и на плановый период 2025 г.).