Сравнительная оценка методов защиты миокарда с анализом повреждения днк кардиоцитов у детей первого года жизни

Изучение вопросов адекватности защиты миокарда у детей первого года жизни с морфологической оценкой современными лабораторными методами крайне актуально, так как вносит вклад в более глубокое понимание интраоперационной патофизиологии сердечной мышцы, а также способствует профилактике послеоперационных осложнений. Известно, что при острой ишемии и реперфузии миокарда происходит усиление перекисного окисления липидов [1,7, 8]. Оксидативный стресс приводит к повреждению наиболее важных полимеров - нуклеиновых кислот, белков и липидов. Активные формы кислорода (АФК) вызывают повреждения ДНК, окисление оснований, их модификации, разрывы цепей, повреждения хромосом [1,3, 19]. Из лизосомальных ферментов активируются прежде всего эндонуклеазы, что приводит к гидролизу и расщеплению ДНК, вследствие чего происходит кариопикноз, кариорексис, кариоли-зис. Активируются также протеазы, вследствие чего происходит деструкция и переваривание эндоскелета. Активация фосфолипаз приводит к разрушению мембран и выходу лизирующих ферментов с фрагментами органелл в цитоплазму клетки, вследствие чего образуется очаг воспаления, а в крайнем варианте очаги некроза.

Активизация эндонуклеаз, повреждающих ДНК, происходит при повышении концентрации внутриклеточного Ca2+, наблюдаемом в ходе окислительного стресса [8]. В результате действия АФК на молекулу ДНК возникают хромосомные аберрации, которые представляют собой нарушения структуры хромосомы [2]. Как известно, апоптоз может быть индуцирован гипоксией и реперфузией миокарда, инфарктом миокарда, инсультом [11,13-18].

Проблема оценки состояния миокарда на этапах коррекции ВПС с комплексным морфологическим анализом по-прежнему остается актуальной [4, 5]. В предыдущих наших исследованиях оценка адекватности защиты миокарда у пациентов первого года жизни проводилась методом лазерно-индуцированной флуоресценции с определением степени фрагментации ДНК в ядре и цитоплазме кардиоцитов [9]. Это характеризу ет новый аспект в оценке жизнеспособности миокарда при коррекции ВПС на новом методическом уровне. В исследованиях НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН был представлен классический анализ ультраструктуры кардиоцитов на этапах коррекции ВПС у детей первого года жизни методом электронной микроскопии, где выявлены преимущества раствора «Custodiol» перед ФХКП [10]. В то же время в работах украинских коллег на основании данных интраоперационной электронной микроскопии у пациентов ВПС первого года жизни выявлены преимущества использования ФХКП с концентрацией раствора калия хлорида 30 ммоль/л, перед раствором Св.Тома-са [6]. Таким образом, до настоящего времени изучаемые вопросы остаются предметом дискуссии. В доступных нам информационных источниках исследований по морфофункциональной оценке миокарда с анализом интраоперационного повреждения ДНК кардиоцитов на этапах коррекции ВПС при 3-х вариантах защиты миокарда нами не найдено.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследовано 28 пациентов с ВПС (13-ДМЖП, 5-АВК, 8-ТФ, ДОМС от ПЖ-1, критический КСЛА-1). Средний возраст 11,0±0,6 месяцев. Для защиты миокарда у 9 пациентов использовалась ФХКП, у 7 - кровяная кардиоплегия, у 12 - раствор «Custodiol». Средняя окклюзия АО - 54±3,1 мин, ИК - 99±4,3 мин. По длительности пережатия АО и времени ИК группа ФХКП (44,2±3,1; 80,8±3,3) статистически не различалась с группой кровяной кардиоплегии (48,8±3,7; 97,0±5,5). В группе «Custodiol» длительность пережатия АО и время ИК (60,0±3,8; 112,1±5,4) достоверно отличались (р<0,05, критерий Стьюдента) от вышеописанных групп.

Забор биопсии из ушка правого предсердия производили на следующих этапах операции: 1) перед пережатием АО, 2) после открытия АО, 3) на 30-й минуте реперфузии. Оценка результатов проводилась на люминесцентном компьютеризированном микроскопе с определением интен- сивности флуоресценции и с последующим вычислением процентного соотношения фрагментированной ДНК в ядре и цитоплазме кардиоцитов.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ OFFICE XP, пакета статистических программ STATISTICA 6.0. В качестве достоверных считали результаты при достижении уровня значимости р < 0,05, для характеристики тенденции указывали уровень p < 0,1. Методы статистики: непараметрический коэффициент корреляции Спирмена (rho), достоверность различия между двумя группами оценивали непараметрическими критериями Манна-Уитни, Уилкок-сона. Если число сравниваемых групп превышало две, использовали непараметрический тест Краскелла-Уоллиса, для сравнения средних значений использовался критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для пациентов в группах ФХКП и кровяной кардиоплегии определялись статистически достоверные различия процентного содержания фрагментированной ДНК в цитоплазме кардиоцитов относительно ядра между 1 и 2, а также 1 и 3 этапами (р<0,05, t-test) в сторону увеличения процентного содержания фрагментированной ДНК в цитоплазме на этапах 2 и 3 операции. В группе пациентов «Custodial» различий в показателях между 1 и 2, а также между 1 и 3 этапами не найдено. Динамика процентного соотношения фрагментированной ДНК в цитоплазме кардиоцитов относительно ядра на этапах коррекции ВПС у детей первого года жизни при применении ФХКП, кровяной кардиоплегии и раствора «Custodial» представлена на рисунке.

При сравнительной оценке трех методов кардиопротекции на втором этапе статистически значимых различий показателей между группами не найдено (критерий Крускала-Уоллиса). На третьем этапе определяются статистически значимые различия (критерий Крускала-Уоллиса) между группа-

100 -,

68 ?0

80 -

60 -

%

40 -

Кустодиол

Кристаллоид- Кровяная ная кардиоп- кардиоплегия легия

□ 1 этап □ 2 этап ц 3 этап

Сравнительная оценка методов защиты миокарда.

ми ФХКП - «Custodial», кровяная кардиоплегия -«Custodial» в сторону меньшего процентного содержания показателя при использовании раствора «Custodiol» (р<0,05). Корреляционной зависимости исследуемого показателя с длительностью окклюзии АО при трех методах кардиопротекции не обнаружено (корреляционный анализ по Спирмену). У двоих пациентов с неблагоприятным исходом зарегистрировано соотношение показателей ядро-цитоплазма 1:1 на этапах 2 и 3 операции. Клинические критерии адекватности защиты миокарда при применении ФХКП, кровяной кардиоплегии и раствора «Custodiol» представлены в таблице.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нашими исследованиями установлено, что на этапах коррекции ВПС у детей первого года жизни при применении ФХКП и кровяной кардиоплегии имеет место дефрагментация ДНК с достоверным повышением показателя в цитоплазме кардиоцитов относительно ядра на этапах аноксии и реперфузии. Учитывая механизмы повреждения структуры ДНК, описанные выше, данное исследование указывает на наличие интраоперационной гипоксии миокарда, активизации процессов перикисного окисления липидов (ПОЛ), индукции механизмов некроза и апоптоза кардиоцитов.

Нами установлен факт наличия фрагментированной ДНК в цитоплазме кардиоцитов, что свидетельствует о повреждении ядерных мембран. Нашими исследованиями выявлено, что при использовании раствора «Custodiol» нет статистических различий в показателях на трех исследуемых этапах, что указывает на менее выраженные ультра-структурные и метаболические сдвиги в миокарде и дает преимущества данному методу кардиопротекции. Немаловажен и факт, что в группу «Custodiol» вошли пациенты с наиболее сложными пороками, в том числе и с цианотическими, а сроки выключения сердца из кровообращения были достоверно более длительными (длительность пережатия АО и время ИК 60±3,8;112,1±5,4).

Результаты нашего исследования согласуются с данными из НЦССХ им. А.Н. Бакулева, где по классическим морфологическим характеристикам эффективности защиты миокарда констатировано отсутствие достоверных изменений показателей митохондриального индекса и запасов гликогена в период аноксии и реперфузии при коррекции ВПС у детей первого года жизни при защите миокарда раствором «Custodiol» и снижение этих показателей при использовании ФХКП [10].

Дальнейший детальный анализ клинических характеристик адекватности защиты миокарда в нашей работе подтвердил результаты морфологической оценки. Так, в группе «Custodiol» по сравнению с группами ФХ КП и кровяной кардиоплегии по па-

Клинические критерии адекватности защиты миокарда при применении ФХКП, кровяной кардиоплегии и раствора «Custodiol»

Критерии ФХКП (п=9) Кровяная кардиоплегия (п=7) Раствор «Custodiol» (п=12) Восстановление сердечной деятельности через A-V блок 6 (67%) 3 (43%) 3 (25%) через фибрилляцию 1 (8%) Нарушения ритма в ближайшем послеоперационном периоде блокада правой ножки пучка Гиса фибрилляция 6 (67%) 2 (29%) 5 (42%) предсердный ритм 1 (11%) ритм A-V узла 1 (11%) предсердная экстрасистолия 1 (11%) 1 (14%) 1 (8%) пароксизмальная тахикардия 1 (11%) удлинение электрической систолы желудочков 1 (11%) 4 (57%) нет Ухудшение метаболизма миокарда (ЭКГ) 4 (44%) 4 (57%) нет Нарушения локальной сократимости миокарда (Эхо КГ) 1 (11%) 1 (14%) нет раметрам ЭКГ не отмечено случаев ухудшения метаболизма миокарда и гемодинамически значимых нарушений ритма, а по данным ЭхоКГ - фактов нарушения локальной сократимости сердечной мышцы. Таким образом, нашей работой установлено, что при применении ФХКП и кровяной кардиоплегии метаболическая «цена адаптации» миокарда после этапа аноксии и реперфузии значительно выше, что клинически соответствует более частому возникновению нарушений проводимости и нарушений ритма на фоне ухудшения метаболизма миокарда. Эти выводы согласуются с данными экспериментальных исследований нашего института, в которых при оценке жизнеспособности миокарда методом лазерно-индуцированной флуоресценции было доказано снижение устойчивости проводящих структур сердца к ишемии по сравнению с рабочими кардиоцитами [8]. Нами зарегистрированы нарушения локальной сократимости сердечной мышцы у двоих пациентов из группы ФХКП и кровяной кардиоплегии. Метаболическим «выходом» из данной ситуации, по-видимому, является механизм гибернации миокарда [12]. У двух летальных пациентов при различных видах защиты миокарда на этапе аноксии и реперфузии зарегистрировано соотношение показателя, приближающееся к 1:1 с одновременным снижением интенсивности флуоресценции. В эксперименте уже отмечалось, что снижение интенсивности флуоресценции скорее всего связано с потерей ядерного материала по мере нарастания миокардиальной ги поксии [8]. В обоих случаях в послеоперационном периоде наблюдалась тяжелая сердечная недостаточность. У одного пациента наблюдалась клиника «оглушенного миокарда» (stunning myocard), в то же время в другом случае сердечная недостаточность соотносилась с терминальной стадией порока (легочная гипертензия 3 стадии) и кризовым течением послеоперационного периода.

ВЫВОДЫ

• 1.    При коррекции ВПС у детей первого года жизни при применении ФХКП и кровяной кардиоплегии на этапе аноксии и реперфузии происходит увеличение показателя повреждения ДНК кардиоцитов по сравнению с исходными параметрами с выходом фрагментированных участков ДНК в цитоплазму и соответствующей дефрагментацией ядра.

• 2.    Отсутствие достоверных различий показателя повреждения ДНК кардиоцитов на этапах операции при использовании раствора «Custodiol» указывает на сохранность ультраструктуры миокарда по сравнению с методами ФХКП и кровяной кардиоплегии, что дает преимущества раствору «Cus-todiol».

• 3.    Факт интраоперационного повреждения структуры ДНК, более выраженного при применении ФХКП и кровяной кардиоплегии, косвенно отражает наличие гипоксии миокарда, активизации процесса ПОЛ, индукции механизмов некроза и апоптоза кардиоцитов.

• 4.    Наличие фрагментированной ДНК в цитоплазме кардиоцитов свидетельствует о повреждении их ядерных мембран.

• 5.    Отсутствие корреляционной зависимости показателя повреждения ДНК кардиоцитов с длительностью выключения сердца из кровообращения при трех вариантах защиты миокарда свидетельствует об относительной адекватности кардиопротекции, что соответствует благоприятному течению послеоперационного периода у 26 пациентов.

• 6.    Сравнительная морфофункциональная оценка применения ФХКП и кровяной кардиоплегии по сравнению с раствором «Custodiol» показывает, что «цена адаптации» оперированного сердца в группах ФХКП и кровяной кардиоплегии обеспечивается большим напряжением физиологических функций - это клинически соответствует более частому возникновению транзиторных ишемических нарушений метаболизма миокарда, нарушений проводимости и нарушений ритма, а также локальных нарушений сократимости, возникающих в раннем послеоперационном периоде.