Сравнительная оценка остеоинтеграции новых чрескожных имплантатов из ультрамелкозернистого сплава Ti Grade 4

Применение титановых сплавов в наноструктурном и ультрамелкозернистом (УМЗ) состояниях, а также модификация поверхности в настоящее время представляют собой универсальную стратегию для повышения механических свойств и биосовместимости медицинских изделий [1, 2]. Для практики ортопедии в этой части актуальными являются исследования остеоинтеграции чрескожных имплантатов из титановых сплавов с различным химическим составом, структурой и покрытием [3-6]. Показано, что остео-интегрируемые титановые имплантаты из материалов со структурированной поверхностью обеспечивают повышенную скорость остеоинтеграции [7, 8]. В большей степени это изучено для изделий, используемых в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии [9-11]. Тем не менее, эти исследования делают перспективным направлением улучшение характеристик приживаемости чрескожных имплантатов, внедряемых в настоящее время для решения задач остеоинтеграци-онного протезирования [12-14].

Цель – провести сравнительную оценку эффективности остеоинтеграции новых чрескожных имплантатов для протезирования, изготовленных из ультрамел-козернистого сплава Ti Grade 4.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на 12 кроликах-самцах породы Советская шиншилла, возраст – 6-10 месяцев, средний вес – 3,2 ± 0,3 кг. Премедикацию для операции осуществляли путем внутримышечного введения димедрола 1 % 10 мг/кг, атропина 0,01 % 0,05 мг/кг, медитина 0,1 % 1 мг/кг, золетила 100 0,025 мг/кг, наркоз производили внутривенно препаратом пропофол 1 % 10 мг/кг. Всем кроликам производили остеотомию большеберцовой кости на границе верхней и средней трети. Далее рассверливали костномозговой канал до 4,5 мм и вкручивали в культю большеберцовой кости имплантат (патент № 152558) диаметром 5 мм. Животным опытной группы (n = 6) устанавливали тита- новые имплантаты из ультрамелкозернистого сплава Ti Grade 4 (рис. 1, а), животным контрольной группы (n = 6) устанавливали титановые имплантаты из стандартного сплава Ti6Al4V (рис. 1, б). Установка имплантатов представлена на рисунке 1, в. Культю голени формировали миопластическим способом с использованием одного кожно-фасциального лоскута.

Далее на кость устанавливалось компрессионное устройство (патент № 2631631) с протезом из фторопласта (рис. 2). Кость подвергалась компрессионной нагрузке 3,5 Н в течение 5 недель после имплантации. Выбор величины компрессионной нагрузки обоснован нами в ранее выполненном исследовании [15].

Рис. 1. Имплантаты из ультрамелкозернистого сплава Ti Grade 4 после механической обработки (а) и сплава Ti6Al4V после селективного лазерного сплавления (б); установка имплантатов в культю большеберцовой кости кролика (в)

Рис. 2. Рентгенограмма культи большеберцовой кости кролика после операции (а) и фото кролика с установленным имплантатом в устройстве внешней фиксации с компрессионным нагружением (б)

Таблица 1 Механические свойства и среднее арифметическое отклонение микропрофиля резьбовой поверхности имплантатов

Тип имплантата	СЛС Ti6Al4V (контроль)	Механическая обработка УМЗ сплава Ti Grade 4 (опыт)
σ 0,2, МПа	1045	1071
σ в, МПа	1200	1240
δ , %	8	11
Ra, мкм	5,59	0,95

Дополнительно для оценки структурных изменений, происходящих в процессе токарной обработки опытного имплантата, нами на сканирующем электронном микроскопе Zeiss CrossBeam AURIGA в режиме анализа дифракции обратно рассеянных электронов (EBSD) выполнено исследование микроструктуры материала имплантатов после механической обработки. На рисунке 3 представлены микрошлифы резьбовой части имплантата, результаты EBSD-анализа растровой электронной микроскопии и гистограмма распределения размеров зерен микроструктуры, построенная с использованием программного пакета SIAMS 700.

Результат EBSD-анализа показал, что исследуемая микроструктура является смешанной ультрамелкозер-нистой и нанокристаллической с отдельными крупными зернами размером до 2 мкм. Превалируют зерна размером от 100 до 300 нм, их количество составляет порядка 28 %. Присутствует также большое количество нанокристаллитов с размерами менее 100 нм, содержание которых достигает 32 %. Наличие таких нанокристаллитов в материале резьбовой поверхности имплантата предполагает существенное повышение эффективности остеоинтеграции.

Содержание животных . В ходе исследования животные содержались в клетках по одному животному с емкостями для корма и воды. Влажную уборку клеток проводили ежедневно. Корм раздавался животным один раз в день, чистая питьевая вода – без ограничений. Перед поступлением в эксперимент животные проходили карантин в течение 21 суток. Наблюдение животных в ходе эксперимента осуществляли ежедневно, оценивали общее состояние, дыхание, функцию оперированной конечности, а также состояние послеоперационных ран. Длительность наблюдения всех животных составила 26 недель после имплантации. Эвтаназию животных осуществляли путем введения летальных доз барбитуратов.

Рентгенологические исследования . Для рентгенографии использовался рентгеновский аппарат «Compact», (Милан, Италия). Сила тока составляла 60 мА, напряжение 57-69 кV, время экспозиции - 0,4-0,6 сек. Конкретные параметры работы аппарата зависели от конституции животного. Рентгенографию конечности кролика выполняли в прямой и боковой проекции. Рентгенографию проводили до и после оперативного вмешательства, на 21, 42, 84, 105 180 сутки после операции.

Морфологическое исследование . Большеберцовую кость с интегрированным в нее имплантатом помещали в 10-процентный раствор нейтрального формалина. Через 7 суток фиксации кость распиливали в продольном направлении, оставляя имплантированную конструкцию в одной из половин распила, обнажая лишь поверхность имплантата, а затем продолжали фиксацию в формалине еще 3-5 суток. Далее половину культи большеберцовой кости, где оставался имплантат, обезвоживали в этиловом спирте (по 2 смены 70, 80, 96 и 100 градусной крепости), заливали в 2,2-диметил-3-метиленбицикло[2,2,1]гептан и сушили в открытой емкости до полного его испарения. Высушенные распилы напыляли токопроводным слоем Pt и Pd и исследовали методом сканирующей микроскопии при помощи электронного микроскопа Zeiss EVO MA18 (Carl Zeiss Group, Германия). Распределение Са и Р в тканях, адгезированных на поверхности интегрированных имплантатов, выполняли с использованием энергодисперсионного спектрометра BRUKER QUANTAX 200 – XFlash 6/10 (Bruker Nano GmbH, Германия). Работа осуществлялась в режиме построения элементных карт, спектров и получения цифровых данных о содержании каждого остеотропного элемента.

Рис. 3. Фото микрошлифов резьбовой части имплантата (а); фазово-контрастный EBSD снимок α -фазы поверхностного слоя резьбы (б); гистограммы распределения размеров зерен материала имплантата после токарной обработки (в)

Фрагменты культи большеберцовой кости без имплантата декальцинировали в смеси соляной и муравьиной кислот, дегидратировали и заливали в парафинсодержащие смеси, способные к затвердеванию. На микротоме санного типа Reichard (Германия) изготавливали парафиновые срезы толщиной 6 мкм, которые после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином. Далее их исследовали с помощью стереомикроскопа AxioScope A1 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия).

Лабораторные исследования . В динамике эксперимента выполняли забор крови на сроках до операции, через 3, 5, 12 и 26 недель после имплантации. Выполняли комплекс биохимических и гематологических исследований, включавших определение концентрации общего белка, С-реактивного белка (СРБ), креатинина, мочевины, общего кальция, неорганического фосфата, оценку активности фосфатаз (щелочная фосфатаза – ЩФ; костный изофермент кислой фосфатазы – ТрКФ) и трансаминаз (АЛТ, АСТ), определение содержания лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов.

Гематологические исследования выполнены на автоматическом анализаторе ProCyte Dx (IDEXX Lab., Нидерланды), биохимические – на автоматическом анализаторе Hitachi/BM 902 (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Италия) с использованием наборов реагентов Вектор-Бест (Россия).

Регулирующие стандарты . Исследование выполнено в соответствии с ГОСТом ISO 10993-1-2021.

Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования в процессе менеджмента риска; ГОСТом ISO 10993-6-2021. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследования местного действия после имплантации.

Этические принципы . До начала исследования было получено одобрение локального этического комитета, прокол № 1(71) от 28.04.2022. Исследование проведено при соблюдении принципов гуманного обращения с лабораторными животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей, и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях.

Статистические методы . Результаты в таблицах 2 и 3 представлены в виде медианы, 1-3 квартиля (Me; Q1-Q3). Нормальность выборок определяли с помощью критерия Шапиро – Уилка. Процедуру статистической оценки значимости отличий показателей на сроках эксперимента с дооперационными значениями проводили с использованием W-критерия Вилкоксона. Достоверность различий между группами оценивали с помощью T-критерия Манна-Уитни. Минимальный уровень значимости (р) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В постимплантационном периоде отмечено, что общее состояние кроликов обеих групп было удовлетворительным. Опорная функция конечности восстанавливалась на 4-5-е сутки после операции и в дальнейшем присутствовала у животных опытной и контрольной группы на всем протяжении наблюдения. Во всех экспериментах не было выявлено воспаления и гнойных процессов кожи в месте выхода имплантата. Выпадения имплантатов к моменту эвтаназии (26 недель) у экспериментальных животных обеих групп не отмечено. Каких-либо серьезных нежелательных событий в ходе наблюдения не обнаружено, нагноения в области культи и периимплантном пространстве не выявлено. При патоморфологиче-ском исследовании животных после эвтаназии каких-либо патологических изменений внутренних органов не обнаружено.

Во всех случаях у животных опытной группы через 26 недель после имплантации рентгенологически отмечалась полная органотипичеcкая перестройка кости (рис. 4, а). У кроликов группы контроля также во всех случаях отмечалось отсутствие нестабильности имплантата, однако в двух случаях определяли незначительную резорбцию на интерфейсе «имплантат-кость» (рис. 4, б).

Гистологически через 26 недель эксперимента у животных опытной группы на всем протяжении культи большеберцовой кости в компактной пластинке не выявлено её порозных изменений, расширения гаверсовых каналов, выраженной остеокластической резорбции (рис. 5). В проксимальной части культи метафизарная кость была практически не изменена и представлена крупно- и среднеячеистой губчатой костью с жировым костным мозгом в межтрабекулярных промежутках (рис. 5, б, д). Вокруг имплантата формировался повторяющий его форму костный футляр, представленный пластинчатой костной тканью (рис. 5, в). Костная ткань вплотную без зазоров и без соединительнотканной прослойки прилегала к структурам имплантата (рис. 5, а). В проксимальной части костно-имплантационного блока в новообразованной на поверхности имплантата кости обнаруживались немногочисленные резорбционные полости (рис. 5, г). Костная ткань, врастающая в межрезьбовые промежутки имплантата, была высоко минерализована и ва-скуляризована (рис. 5, е).

Рис. 4. Рентгенограммы голени кроликов через 26 недель после имплантации: а – опытная группа; б – группа контроля

Рис. 5. Проксимальный участок культи большеберцовой кости животных опытной группы: а – распил большеберцовой кости кролика с установленным имплантатом; б – гистотопограмма распила большеберцовой кости кролика после извлечения имплантата. Ув. 1,5×; в – формирование костного футляра на поверхности интегрированного имплантата. Ув. 50×; г – резорбционные полости на поверхности костного футляра. Ув. 200×; д – метафизарная кость. Ув. 200×; е – костная ткань в межрезьбовых пространствах. Ув. 200×. Окраска: б – по Ван-Гизону; в-д – гематоксилином и эозином; е – по Массону

Гистологически в группе контроля через 26 недель эксперимента между поверхностью СЛС-имплантата и костной тканью наблюдался плотный контакт, что обеспечивало прочное удержание имплантата в ложе кости. К данному периоду сформировался единый костно-имплантационный блок. На всем протяжении культи кости сохранялась непрерывная компактная пластинка. Выраженных периостальных напластований не обнаруживалось. В дистальной и средней частях культи большеберцовой кости отмечали врастание костной ткани в резьбовые межреберные углубления имплантата (рис. 6, а, б).

Исследования, выполненные методом сканирующей электронной микроскопии, показали полную интеграцию костной ткани в структурные поверхности имплантата (межрезьбовые углубления, отверстия структурах имплантата) на всем протяжении контакта кость–имплантат у животных опытной группы (рис. 7).

В контрольной группе плотный контакт костной ткани и ее интеграцию в поверхностные структуры имплантата также подтверждают данные энергодисперсионного анализа в виде электронных карт распределения остеотропных элементов в структурах распила костно-имплантационного блока (рис. 8).

Методом рентгеновского электронно-зондового микроанализа обнаружено, что в субстрате формирующегося на поверхности имплантата у кроликов опытной группы кальция было достоверно больше во всех областях имплантата относительно животных группы контроля (табл. 2). Содержание фосфора на поверхности имплантата у животных опытной группы также было статистически значимо выше относительно контроля в проксимальной и срединной области имплантата.

В динамике эксперимента отмечены различия в активности фосфатаз в сыворотке крови экспериментальных животных (табл. 3). Так, у кроликов опытной группы отмечалось повышение активности ЩФ через 12 недель после имплантации относительно доопераци-онных значений. У животных группы контроля активность ЩФ, наоборот, снижалась на 3 неделе, а на 3-й и 5-й повышалась активность костного изофермента кислой фосфатазы. Также у животных группы контроля относительно опытной группы дольше удерживался повышенный уровень СРБ сыворотки крови.

Рис. 6. Формирование блока «кость-имплантат» у животных группы контроля через 26 недель эксперимента: а – распил большеберцовой кости кролика с установленным имплантатом; б – гистотопограмма распила большеберцовой кости кролика после извлечения имплантата. Окраска по Ван-Гизону. Ув. 1,5×

Рис. 7. Карты распределения остеотропных элементов в различных участках костно-имплантационного блока через 26 недель эксперимента, опытная группа: а – проксимальная область, б – срединная область, в – дистальная область. Рентгеновский электроннозондовый микроанализ. Ув. 68×

Рис. 8. Карты распределения остеотропных элементов в различных участках костно-имплантаионного блока через 26 недель эксперимента, контрольная группа: а – проксимальная область, б – срединная область, в – дистальная область. Рентгеновский электроннозондовый микроанализ. Ув. 68×

Таблица 2

Содержание кальция и фосфора (вес %) на поверхности имплантата в различных участках культи большеберцовой кости кролика через 26 недель эксперимента, Ме (Q1-Q3)

Область исследования	Кальций, вес %		Фосфор, вес %
	опыт	контроль	опыт	контроль
Проксимальная	13,6 (13,0-14,1)*	7,3 (6,9-7,6)	4,1 (3,9-4,3)*	3,6 (3,5-3,6)
Срединная	15,8 (15,2-16,3)*	9,1 (8,9-9,4)	5,5 (5,1-5,8)*	4,6 (4,4-4,7)
Дистальная	12,2 (11,7-12,6)*	10,3 (10,0-10,5)	3,9 (3,7-4,2)	4,5 (4,2-4,8)

Примечания: * – достоверные отличия относительно группы контроля при р < 0,05.

Таблица 3

Изменения некоторых биохимических показателей сыворотки крови кроликов экспериментальных групп на сроках наблюдения (недели), Ме (Q1-Q3)

Показатель	Группа	0	3	5	12	26
ЩФ, Е/л	О	51 (50-59)	45 (38-49)	59 (54-61)	67#(62-73)	60 (52-62)
	К	53 (48-63)	42#(38-46)	51 (49-56)	58 (45-66)	61 (56-66)
ТрКФ, Е/л	О	28 (24-30)	30 (28-36)	33 (28-40)	25 (21-29)	19 (18-29)
	К	26 (22-26)	41#(35-42)	34#(29-38)	20 (16-28)	20 (16-29)
С-РБ, мг/мл	О	0 (0-1)	14#(4-30)	12 (2-20)	5 (0-7)	2 (0-2)
	К	0 (0-1)	13#(6-22)	10#(4-17)	2 (0-3)	4#(2-21)

Примечание: # – достоверные отличия с дооперационными значениями при р < 0,05. О – опытная группа; К – контрольная группа.

Другие изученные лабораторные показатели (общий белок, креатинин, мочевина, трансаминазы, общий кальций, неорганический фосфат, лейкоциты, эритроциты, тромбоциты) статистически значимо относительно дооперационных значений в обеих группах в динамике наблюдения не изменялись (данные не представлены). Не отмечено и существенных отклонений лабораторных показателей при анализе индивидуальной динамики по каждому животному.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что процесс остеоинтеграции чрескожного имплантата со смешанной ультрамелкозерни-стой и нанокристаллической структурой был лучше относительно изделия сравнения. На это указывают данные количественных показателей рентгеновского электронно-зондового микроанализа, которые показали более высокое содержание кальция в новообразованной костной ткани на поверхности имплантата на всем протяжении костно-имплантационного блока у животных основной группы. На активацию остеогенеза в зоне имплантации указывает и дина- мика активности щелочной фосфатазы у кроликов опытной группы. Изменения лабораторных показателей позволяют говорить также о том, что биосовместимость имплантата из материала с ультрамелко-зернистой и нанокристаллической структурой была выше относительно СЛС-имплантата. Во-первых, у животных группы контроля отмечалась остеолитическая реакция, о чем свидетельствовал рост активности ТрКФ и зафиксированные у двух животных рентгенологические признаки. Во-вторых, острофазная реакция на имплантацию у животных группы контроля, исходя из динамики СРБ, была более длительной относительно животных опытной группы. Стоит отметить, что отсутствие выраженных осложнений и значительных клинико-лабораторных отклонений у животных обеих групп в ходе всего эксперимента также говорит и о приемлемой безопасности тестированных изделий.

Полученные нами данные согласуются с многочисленными результатами других экспериментальных исследований, в которых однозначно отмечено, что титановые имплантаты со структурированной поверхностью в сравнительных исследованиях показывают повышенные характеристики остеоинтеграции относительно имплантатов без модификации структуры материала резьбовой поверхности [18-24]. Однако используемые экспериментальные модели в этих работах существенно отличаются от нашей модели. Так, в ряде работ [18, 21, 22] устанавливали дентальный имплантат в объем кости сегментов задних конечностей экспериментальных животных. В других работах дентальные имплантаты со структурированной поверхностью имплантировали по месту применения – в челюсть [19, 23, 24]. В статье Nan-Jue Cao и др. [19] с помощью SMAT-технологии титановому имплантату смогли придать градиентно наноструктурированную поверхность (GNS Ti). Установлено, что по сравнению с крупнозернистым титаном CG поверхность GNS Ti стимулирует адгезию, пролиферацию и дифференцирование клеток и улучшает остеогенез и остеоинтеграцию.

В одной из работ [20] рассмотрены преимущества остеоинтеграции титанового имплантата, поверхность которого модифицирована путем покрытия остеогенными нановолокнами, в состав которых входит поликапролактон, желатин, гидроксиапатит, дексаметазон, бета-глицерофосфат и аскорбиновая кислота. В эксперименте на кроликах титановые имплантаты с остеогенным нановолоконным покрытием показали лучшие результаты, чем контрольные образцы без покрытия. Кроме того, в регенерированной ткани вокруг имплантата отсутствовали патологические изменения.

Отдельно стоит выделить работу C.F. Jones с соавт., в которой показана эффективность остеоинтеграции имплантатов с наноструктурированной поверхностью как в губчатую кость, так и в кортикальную [27].

Нами встречены единичные работы, в которых отмечаются преимущества в части интеграции именно чрескожных имплантатов с модифицированной поверхностью, причем авторы этих работ указывают на улучшение интеграции этих имплантатов с мягкими тканями [25, 26].

В целом, экспериментальные работы по исследованию остеоинтеграции модифицированных имплантатов продолжаются. Показано, например, что в основе эффективности биоинтеграции таких имплантатов могут быть задействованы генетические механизмы [28]. Отмечается, что внедрение поверхностных модификаций биосовместимых металлов является лучшим решением для повышения характеристик коррозионной стойкости таких изделий [29]. Перспективное направление – включение в модифицированную поверхность ионов отдельных металлов [30, 31].

Несмотря на достаточно большой объем экспериментальных исследований, клинический опыт применения титановых имплантатов с объемной или поверхностной ультрамелкозернистой наноструктурой ограничен. Причиной этому может явиться то, что некоторые аспекты применения данных изделий в экспериментальных исследованиях до сих пор изучены мало. В этом плане стоит выделить работу [32], в которой отмечается, что в исследованиях влияния модификации структуры титановых имплантатов практически не изучаются топографические и химические изменения поверхностей после остеоинтеграции, не описаны осложнения их применения, не освещается выживаемость изделий в долгосрочном периоде, особенно с учетом условий постоянной нагрузки на кость. А. Jayasree с соавт. отдельно отмечают, что выявленные в большинстве экспериментальных работ положительные эффекты остеоинтеграции могут быть связаны с тем, что имплантат у животных, как правило, не несет механических нагрузок, поэтому для преодоления такого разрыва в долгосрочной перспективе необходимы исследования in vivo на крупных моделях животных с механической нагрузкой [33].

Оценивая в целом текущее состояние тематики можно отметить, что преимущество проведенного нами исследования заключается в том, что титановые имплантаты со смешанной ультрамелкозернистой и на-нокристаллической структурой были изучены на модели, приближенной к модели клинического применения, с достаточно длительным сроком наблюдения. Это делает перспективным применение таких имплантатов для решения клинических задач протезирования. Очевидно, что ограничения данного исследования касаются объемов выборок экспериментальных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты исследований на кроликах показали, что применение чрескожных имплантатов, изготовленных из сплава Ti Grade 4 со смешанной на-нокристаллической и ультрамелкозернистой структурой методом механической обработки, в условиях компрессионного нагружения 3,5 Н в течение 5 недель позволяет улучшить характеристики остеоинтеграции в сравнении с СЛС-имплантатами из титанового сплава Ti6Al4V.