Сравнительная посегментарная оценка молекулярных особенностей слизистой оболочки толстой кишки при ворсинчатых аденомах

To cite this article: Korotkevich AG, Titov SE, Zhilina NM, Demenkov PS, Veryaskina YA, Bondarev OI. Comparative segmental evaluation of molecular features of colonic mucosa in villous adenomas. Surgical practice (Russia). 2024;9(4):16—32.

Гистологическое строение аденом толстой кишки (ТК) имеет вполне определенное значение в понимании онкориска / малигнизации [1; 2]. Известно, что увеличение доли ворсинчатого (папиллярного) компонента существенно повышает риск раковой трансформации [2—4]. Ворсинчатые аденомы (ВА) составляют от 5 до 15 % всех аденом [2], однако далеко не все ВА трансформируются в колоректальный рак (КРР). В ряде случаев в ТК встречаются разные гистологические типы аденом, как и сочетание аденом с колоректальным раком (КРР) [5].

Существует мало исследований, изучающих связь между характеристиками аденомы при исходной колоноскопии и КРР, и еще меньше исследований, в которых проводят анализ КРР по сегментам ТК [1]. Вместе с тем показано, что ВА чаще поражают дистальные отделы ТК [3]. В связи с мнением о преобладании частоты КРР в дистальных отделах ТК и связи с дисплазией возникает вопрос о связи именно ВА с КРР этой локализации [1]. С другой стороны, частота КРР в правой и левой половинах ТК имеет стабильно сохраняющиеся незначительные различия [6]. Некоторые авторы объясняют это преимущественным значением зубчатого пути КРР, особенно для правой половины ТК [4; 7; 8]. Важный вопрос об изменениях слизистой оболочки (СО) в индексных для ВА сегментах ТК и их идентичности изменениям в ВА остается открытым.

До сих пор внимание исследователей было обращено к поиску первопричины возникновения КРР, в том числе на уровне СО ТК [1; 9; 10]. Мы в своем исследовании проверяли факт и тождественность молекулярных изменений в ВА и СО индексного сегмента ТК. Воз- можно, поиск различий или подтверждение одинаковости изменений на молекулярном уровне помогут в совершенствовании программ скрининга КРР или создании инструментов прогнозирования риска КРР.

Целью исследования было определение частоты одиночных ВА по сегментам ТК и сравнение молекулярно-генетических особенностей ВА со СО индексного сегмента и между разными сегментами ТК, как и характеристиками неизмененной СО аналогичных сегментов ТК.

Материал и методы

Сплошное поперечное ретроспективное исследование результатов 3086 колоноскопий в отделении эндоскопии НГКБ № 29 им. А. А. Луцика в 2019—2020 гг. Проспективное исследование (2022—2023) СО ТК у 109 пациентов с ворсинчатыми аденомами. Исследование одобрено локальным этическим комитетом НГКБ № 29 от 19.04.2022 г. Материал был получен в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации, принятой на 18-й Генеральной ассамблее ВМА, (Хельсинки, Финляндия, июнь 1964 г.), с последующими редакциями и положениями действующего законодательства РФ. От каждого пациента было получено информированное добровольное согласие, все данные были деперсонализированы. Использовали эндоскопы высокого разрешения с функцией виртуальной хромоскопии. Биоптаты из каждого отдела толстой кишки помещали на предметное стекло, делали мазок, высушивали. Биоптат СО брали не ближе 10 см от аденомы из индексного сегмента. В мазках определяли относительные уровни экспрессии миРНК и мРНК. Всего в рамках данной работы было исследовано 347 клеточных образцов: ворсинчатых аденом — 109, СО индексного сегмента — 101, нормальной СО — 137 (табл. 1).

Таблица 1. Использованные в работе образцы

Table 1. Samples used in the study

Отдел ТК	Количество образцов
	Ворсинчатая аденома		Слизистая индексного сегмента		Нормальная слизистая		Всего
	Абс.	%	Абс.	%	Абс.	%	Абс.	%
Слепая кишка	4	4	4	4	21	14	29	8
Поперечная ободочная кишка	6	6	6	6	31	23	43	12
Нисходящая ободочная кишка	7	6	10	10	31	23	48	14
Сигмовидная кишка	81	74	76	76	30	22	187	54
Прямая кишка	11	10	5	5	24	18	40	12
Итого	109	100	101	100	137	100	347	100

Для некоторых сравнений (при отсутствии различий между сегментами) образцы поперечной, нисходящей и сигмовидной ободочной кишки объединяли под аббревиатурой ПНС.

Выделение РНК. Цитологический препарат соскребали со стекла в пробирку и добавляли 600 мкл лизирующего буфера (4 М гуанидинизотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,3 % саркозил, 3 % ДТТ). Далее выделение проводили, как описано в статье В. В. Анищенко [11].

Первичный отбор набора миРНК для анализа был осуществлен на основании анализа литературы. В итоге был сформирован список из 9 миРНК-маркеров, связанных с развитием КРР: миР-135b-5p, -141-3p, -143-3p, -200a-3p, -20a-5p, -21-5p, -31-5p, -34a-5p, -92a-3p, в качестве референса для них использовалась малая ядерная (мя) РНК U6, а также миРНК-16-5卩 и -191Kp. Помимо миРНК в данной работе в качестве маркеров были использованы мРНК следующих генов: MUC2, CDX2, NOX1, LGR5, SMAD4, MS4A12, TIMP1, Ki-67, TERT с нормировкой на гены домашнего хозяйства PGK1и PUM1.

Детекция миРНК и мРНК с помощью ОТ-ПЦР-РВ. Для выявления зрелых миРНК и малой РНК U6 использовали метод, предложенный С. Chen с соавт. в 2005 г. Метод включает в себя 面 ратную транскрипцию зрелой миРНК с помощью длинного праймера со шпилькой, с последующей детекцией полученной кДНК с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) [12]. Для каждой миРНК отдельно проводили реакцию обратной транскрипции с последующей ПЦР-РВ. Нормировку содержания миРНК проводили на среднее содержание малой ядерной РНК U6, а также миРНК-16 и -191 в 面 разце с помощью метода 2 -叫 13]. Выявление мяРНКиб осуществлялось по той же схеме stem-loopOT-ПЦР, которая использовалась для миРНК. По-луколичественную оценку содержания мРНК проводили методом ОТ-ПЦР-РВ со специфическими 叩 аймерами и флуоресцентно-мечеными зондами для выявления мРНК соответствующих генов и генов домашнего хозяйства PGK1 и PUM1, используемых для нормировки данных. Уровень относительной экспрессии рассчитывали с помощью метода 2^–ΔCq.

Детекцию соматических мутаций осуществляли с помощью аллель-специфичной ПЦР с гидролизуемым зондом. Протокол ПЦР: предварительный прогрев при 95°С — 2 мин, 50 циклов: денатурация при 94°С — 10 с, отжиг и элонгация: 60°С — 15 с.

Статистический анализ проведен с использованием пакета IBM SPSS Statistics-22 и STATISTICA 10 (TIBCO Software, США). По результатам исследования создана база данных, выполнен ее первичный анализ. Сравнение двух независимых выборок по количественному признаку делали при помощи критерия Манна 一 Уитни, качественных признаков при помощи критерия χ 2. Критический уровень значимости был принят равным 0,000308 с учетом поправки Бонферрони.

Результаты

Общая частота ВА в структуре всех выявленных эпителиальных новообразований представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Структура выявленных эпителиальных новообразований ТК

Fig. 1. Structure of detected colorectal epithelial neoplasms

Анализ частоты ВА по отделам кишки показал преобладание ВА в сигмовидной кишке. Вместе с тем доля ВА в структуре эпителиальных новообразований поперечной и восходящей кишки были одинаковы, но достоверно от нисходящей и 叩 ямой кишки не отличались (рис. 2).

Рис. 2. Частота одиночных ВА по сегментам ТК

Fig. 2. Frequency of single VAs by colon segments

Гистологическая оценка ВА в соотношении с их диаметром подтвердила известную зависимость увеличения доли тяжелой дисплазии от размера ВА (рис. 3).

Рис. 3. Частота и тяжесть дисплазии в зависимости от диаметра ВА Fig. 3. Frequency and severity of dysplasia as a function of VA diameter

В исследуемой выборке образцов мы выявляли соматические мутации в 600-м кодоне гена BRAF, 12/13-м и 61-м кодонах генов KRAS и NRAS, а также статус микросателлитной нестабильности (MSI/MSS). Среди ворсинчатых аденом чаще всего выявлялась мутация в 12/13-х кодонах гена KRAS — 37,6 %, далее по частоте встречаемости следует мутация в 600-м кодоне гена BRAF — 4,6 % и мутация в 61-м кодоне гена KRAS — 2,8 %, остальные мутации, включая микросателлитную нестабильность, встретились в 1,8 % случаев. Также мутации в 12/13-м кодонах гена KRAS встретились в 1,2 % нормальной СО ТК (пациенты без

ВА) и 3,0 % СО ТК пациентов с ВА, в последней группе в 1 % случаев обнаружилась мутация в 12/13-м кодонах гена NRAS. Распределение выявленных мутаций между разными типами образцов и разными отделами ТК приведены на рисунке 4.

■ BRAF ■ KRAS-12,13 ・KRAS-Q61 ・NRAS-12 』 3 «NRAS-Q61 "MSS/MSI

Рис. 4. Распределение мутаций в разных типах образцов и в разных отделах ТК

Примечание: слизистая (ВА +) — нормальная слизистая ТК пациентов с ворсинчатыми аденомами; слизистая (ВА–) — нормальная слизистая ТК пациентов безворсинчатых аденом; к. — кишка; о. к. — ободочная кишка.

Fig. 4. Distribution of mutations in different types of samples and in different parts of the colon

Mucosa (ВA +): normal colonic mucosa of patients with villous adenomas; Mucosa (ВA –): normal colonic mucosa of patients without villous adenomas; к. stands for the intestine; о. к. for the colon.

С помощью ОТ-ПЦР-РВ мы определили относительную экспрессию 9 миРНК и 9 бе-лок-кодирующих генов, связанных с развитием КРР. В таблицах 2—4 приведены данные по статистической значимости различий между экспрессией миРНК/мРНК в участках СО, относящихся к разным типам образцов и разным отделам толстой кишки.

Таблица 2. Уровень значимости статистических различий при попарном сравнении экспрессии миРНК/мРНК в разных типах образцов, относящихся к слепой кишке

Table 2. Significance level of statistical differences in pairwise comparisons of miRNA/mRNA expression in different types of specimens related to the cecum

Маркер	Значение P при сравнении групп
	ВА	ВА	Слизистая (ВА +)
	Слизистая (ВА +)	Слизистая (ВА –)	Слизистая (ВА –)
миР-135b	2,86E-02	1,58E-04*	0,543083
миР-141	2,86E-02	6,32E-04	0,409170
миР-143	2,86E-02	1,11E-03	0,914783

Окончание табл. 2

Маркер	Значение P при сравнении групп
	ВА	ВА	Слизистая (ВА +)
	Слизистая (ВА +)	Слизистая (ВА –)	Слизистая (ВА –)
миР-200a	2,86E-02	4,27E-03	0,496443
миР-20a	2,86E-02	3,16E-04	0,747826
миР-21	2,86E-02	6,32E-04	0,914783
миР-31	2,86E-02	1,58E-04*	0,409170
миР-34a	2,86E-02	1,58E-04*	0,914783
миР-92a	2,86E-02	8,38E-03	0,543083
MUC2	1,000000	0,113360	2,85E-03
CDX2	0,885714	0,231304	0,113360
NOX1	2,86E-02	1,58E-04*	0,914783
LGR5	2,86E-02	4,27E-03	0,203162
SMAD	0,685714	0,409170	0,295178
MS4A12	2,86E-02	1,58E-04*	0,591937
TIMP1	0,114286	3,07E-02	0,747826
Ki-67	0,342857	0,081423	0,971383
TERT	0,114286	0,543083	0,409170

Примечание: * выделены значимые (p < 0,000308) различия.

Таблица 3. Уровень значимости статистических различий при попарном сравнении экспрессии миРНК/мРНК в разных типах образцов, относящихся к поперечной, нисходящей, сигмовидной ободочной кишке

Table 3. Significance level of statistical differences in pairwise comparison of miRNA/mRNA expression in different types of samples related to the transverse / descending / sigmoid colon

Маркер	Значение P при сравнении групп
	ВА	ВА	Слизистая (ВА +)
	Слизистая (ВА +)	Слизистая (ВА –)	Слизистая (ВА –)
миР-135b	1,67E-20*	5,70E-30*	1,53E-11*
миР-141	0,072850	0,596234	6,11E-03
миР-143	4,25E-09*	2,09E-17*	2,45E-03
миР-200a	5,17E-04	2,87E-03	0,350145
миР-20a	2,19E-09*	1,98E-05*	1,62E-04*
миР-21	2,76E-11*	4,40E-17*	0,096994
миР-31	9,85E-13*	3,41E-13*	0,467419
миР-34a	9,20E-17*	3,41E-19*	0,340242
миР-92a	7,02E-06*	4,58E-06*	0,353008
MUC2	2,87E-03	0,088404	4,98E-03
CDX2	4,87E-03	4,85E-05*	0,108661

Окончание табл. 3

Маркер	Значение P при сравнении групп
	ВА	ВА	Слизистая (ВА +)
	Слизистая (ВА +)	Слизистая (ВА –)	Слизистая (ВА –)
NOX1	2,58E-04*	2,60E-10*	6,72E-04
LGR5	4,67E-10*	9,32E-15*	1,86E-02
SMAD	0,061857	0,496729	0,155162
MS4A12	2,85E-20*	1,24E-24*	0,065429
TIMP1	1,80E-20*	3,50E-27*	3,65E-02
Ki-67	6,26E-05*	1,68E-12*	1,26E-02
TERT	3,28E-05*	4,31E-16*	1,61E-09*

Примечание: * выделены значимые (p < 0,000308) различия.

Таблица 4. Уровень значимости статистических различий при попарном сравнении экспрессии миРНК/мРНК в разных типах образцов, относящихся к прямой кишке

Table 4. Significance level of statistical differences in pairwise comparison of miRNA/mRNA expression in different types of samples related to the rectum

Маркер	Значение P при сравнении групп
	ВА	ВА	Слизистая (ВА +)
	Слизистая (ВА +)	Слизистая (ВА –)	Слизистая (ВА –)
миР-135b	4,58E-04	4,65E-07*	1,57E-02
миР-141	8,70E-03	0,084873	2,70E-02
миР-143	0,221154	9,49E-03	0,633826
миР-200a	0,377289	0,051794	0,518395
миР-20a	5,49E-03	6,66E-07*	0,414231
миР-21	8,70E-03	1,30E-06*	0,245093
миР-31	5,49E-03	1,54E-05*	0,801280
миР-34a	4,58E-04	4,79E-09*	0,674464
миР-92a	5,49E-03	6,30E-04	0,482304
MUC2	1,000000	0,370496	0,555699
CDX2	3,21E-03	4,34E-02	0,180708
NOX1	1,92E-02	1,64E-02	0,245093
LGR5	8,70E-03	1,54E-05*	0,058979
SMAD	1,000000	0,152209	0,322934
MS4A12	4,58E-04	4,79E-09*	0,977694
TIMP1	3,21E-03	3,24E-04	0,758301
Ki-67	1,000000	0,237932	0,322934
TERT	2,75E-02	0,098978	0,162098

Примечание: * выделены значимые (p < 0,000308) различия.

Наибольшее количество отличий было получено для поперечной, нисходящей, сигмовидной ободочной кишки (ПНС), что, видимо, связано с наибольшим количеством образцов в этой группе. Наибольшее количество статистически значимых различий было выявлено для миРНК-135b, -31, -34a и гена MS4A12. Только для ПНС была зафиксирована статистически значимая разница между СО пациентов с ВА и СО пациентов без ВА для миРНК-135b, -20a и гена TERT.

С использованием данных относительной экспрессии миРНК и мРНК были рассчитаны значения AUC ROC для оценки способности различения ВА и неизмененной СО соответствующего отдела ТК с помощью каждого молекулярного маркера в отдельности (табл. 5).

Таблица 5. AUC ROC всех миРНК и мРНК, рассчитанные для оценки способности различения ВА и неизмененной СО соответствующего отдела ТК

Table 5. AUC ROC for all miRNAs and mRNAs, calculated to assess their ability to distinguish between villous adenomas and unaltered mucosa in the respective colon segment

Маркер	Слепая кишка	ПНС	Прямая кишка
миР-135b	1,000*	0,983*	0,966*
миР-141	0,976*	0,522	0,687
миР-143	0,964*	0,860*	0,773
миР-200a	0,929*	0,627	0,710
миР-20a	0,988*	0,681	0,964*
миР-21	0,976*	0,857*	0,955*
миР-31	1,000*	0,809*	0,920*
миР-34a	1,000*	0,880*	1,000*
миР-92a	0,905*	0,695	0,848
MUC2	0,762	0,572	0,598
CDX2	0,702	0,673	0,718
NOX1	1,000*	0,768	0,756
LGR5	0,857	0,829*	0,922*
SMAD	0,643	0,529	0,653
MS4A12	1,000*	0,935*	1,000*
TIMP1	0,839	0,958*	0,864*
Ki-67	0,792	0,802*	0,627
TERT	0,524	0,838*	0,701

Примечание: * выделены значения AUCROC > 0,8 и 95 % ДИ < 0,25.

Значения AUCROC, равные 1 для слепой и прямой кишки, связаны, по-видимому, с небольшим объемом выборок для этих отделов, тем не менее для ПНС, где объем выборки значительный, AUCROC > 0,9 получился для трех маркеров: миР-135b, MS4A12 и TIMP1.

Сравнение между разными отделами ТК медиан относительных уровней экспрессии наиболее интересных маркеров: генов NOX1, LGR5, S4A12, TIMP, Ki-67 и TERT и миРНК-135b, -20a, -21, -31 и -34a — представлено на рисунках 5 и 6.

Рис. 5. Медианные значения экспрессии генов NOX1, LGR5, MS4A12, TIMP1, Ki-67 и TERT в разных отделах ТК

Примечание: ВА — ворсинчатая аденома; СО (ВА +) — нормальная слизистая ТК пациентов с ВА; СО (ВА –) — нормальная слизистая ТК пациентов без ВА; к. — кишка; о. к. — ободочная кишка.

Fig. 5. Median expression values for NOX1, LGR5, MS4A12, TIMP1, Ki-67 and TERT genes in different parts of the colon

Villous adenoma (VA); mucosa (BA +), normal colonic mucosa of patients with VA; mucosa (BA –), normal colonic mucosa of patients without VA; к. stands for the intestine; о. к. stands for the colon.

MS4A12

TIMP1

Ki-67

TERT

Рис. 6. Медианные значения экспрессии миРНК-135b, -20a, -21, -31 и -34aв разных отделах ТК

Примечание: ВА — ворсинчатая аденома; СО (ВА +) — нормальная слизистая ТК пациентов с ВА; СО (ВА –) — нормальная слизистая ТК пациентов без ВА; к. — кишка; о. к. — ободочная кишка

Fig. 6. Median expression values for miRNA-135b, -20a, -21, -31 and -34a in different parts of the colon

Villousadenoma (VA); mucosa (BA +), normal colonic mucosa of patients with VA; mucosa (BA –), normal colonic mucosa of patients without VA; к. stands for the intestine; о. к. stands for the colon.

Обсуждение

Аденоматозные полипы формируются преимущественно спорадически. Спорадический характер этих полипов является результатом либо мутации в генах, отвечающих за аденоматозный путь развития клетки, либо нарушения репарации ДНК [2; 8]. ВА, как тубу-ловорсинчатые (с долей ворсинчатого компонента < 75 %), так и ворсинчатые (с долей ворсинчатого компонента > 75 %), могут быть связаны с развитием поздних форм неоплазии [2; 3]. Считается, что ВА чаще появляются в ректосигмоидной области, но могут возникать и в других отделах ТК [1; 2]. Это подтверждается и нашими данными. Более крупные ВА с выраженной дисплазией преимущественно концентрируются в дистальном отделе толстой кишки (в левой ободочной и прямой кишке), в частности в нисходящей и сигмовидной частях [3].

Наша оценка частоты встречаемости ВА по сегментам ТК показала существенное преобладание их только в сигмовидной кишке, в прочих сегментах ВА встречались одинаково часто. Вместе с тем сочетания ВА и КРР отличаются по локализации, имеют явную связь с возрастом и дистальным расположением в ТК [4; 10].

Помимо собственно ворсинчатого строения аденом повышение риска развития КРР связано с диаметром опухоли и с их количеством [2; 3; 14]. Возможно, именно большой диаметр ВА, сопровождающийся тяжелой дисплазией, является причиной запущенного КРР. Тем не менее папиллярная структура новообразования определяет условный потенциал злокачественности, требующий поиска и изучения факторов, реализующих развитие КРР. В наших наблюдениях все ВА имели признаки дисплазии разной степени.

Конечно, регулярная колоноскопия доказала свою эффективность в предупреждении КРР путем выявления и удаления всех эпителиальных новообразований [1; 3]. Вместе с тем для формирования групп риска и программ индивидуальной профилактики, на наш взгляд, важным является поиск предикторов в СО, позволяющих при первичном эндоскопическом осмотре и анализе биоптата СО сформировать эти группы.

Сравнение молекулярно-генетических характеристик ВА и СО индексного сегмента показало достоверные различия экспрессии для довольно большого количества маркеров — миР-135b, -143, -20a, -21, -31, -34a, -92a, NOX1, LGR5, MS4A12, TIMP1, Ki-67, TERT, но только для сигмовидной кишки, что, видимо, связано с достаточно большим количеством образцов в этой группе.

Аналогичное сравнение характеристик СО индексного и аналогичного нормального сегмента ТК показало наиболее выраженные изменения СО в ПНС. Там была зафиксирована статистически значимая разница между СО пациентов с ВА и СО пациентов без ВА для миРНК-135b, -20a и гена TERT. В других отделах СО не имела существенных изменений в сравнении с нормальной. Также можно отметить, что направление изменений экспрессии исследованных маркеров в различных отделах СО пациентов с ВА было гораздо ближе к таковому в СО пациентов без ВА, чем собственно в ВА. Исключений для данного наблюдения три, и они относятся к экспрессии белок-кодирующих генов, а не миРНК: экспрессия гена NOX1 в поперечной и нисходящей ободочной кишке, экспрессия генаTERTв поперечной, нисходящей и сигмовидной ободочной кишке и экспрессия гена Ki-67 в поперечной и нисходящей ободочной кишке.

Другими словами, молекулярно-генетическая характеристика ВА не соответствует как СО индексного сегмента, так и нормальной СО соответствующего сегмента ТК. Это ставит под сомнение теорию предраковых полей, созданную на основе анализа метахронных аденом [15].

Заключение

Таким образом, осмотр и биопсия неизмененной СО даже в 叩 еделах индексного сегмента не могут дать представление о риске развития ВА. С другой стороны, выявленные различия в СО по трем молекулярным маркерам, особенно по экспрессии гена TERT, позволяют выделить ПНС как область высокого риска формирования ВА на основе изменений СО этих сегментов ТК.