Сравнительное действие рекомбинантного колицина Е2 на некоторые факторы клеточного иммунитета при аденовирозе телят

Аденовирусные инфекции диагностируются в популяциях крупного рогатого скота во всем мире [1, 2]. Аденовирусы обладают высокой устойчивостью к химическим детергенам и физическим воздействиям, а также при репликации в организме животных и людей могут образовывать внутриядерные включения из вирусных вирионов в виде агломератов кристаллоподобного строения [3, 4].

Аденовирусы строго специфичны, но геном аденовируса 2 типа у крупного рогатого скота на 92% сходен с геномом аденовируса 2 типа человека. При исследнии альтернативного сплайсинга аденовируса 2 типа установлено продуцирование более девятисот типов М-РНК (мессенджерных рибонуклеиновых кислот), кодирующих синтез вирусных белковых компонентов, подавляющих гуморальный и клеточный иммунитет организма животных [5, 6].

В связи с актуальностью изучения действия биологически активных препаратов для лечения телят при аденовирусной инфекции целью нашего исследования являлось изучение сравнительного действия рекомбинантного колицина Е2 (патент №2188233 от 2708.2002, ТУ 9337-01000008064-01) [7, 8] и рекомбинантного интерферона бычьего (БелАгроГен, Беларусь) на некоторые факторы клеточного иммунитета организма телят больных аде-новирозом.

Материалы и методы

Сравнительное действие рекомбинантного колицина Е2 (RecColE2) на некоторые факторы клеточного иммунитета изучали на телятах 3-4-недельного возраста. Были сформированы 3 группы по 10 телят в каждой. Первую (контрольную) группу составляли здоровые телята. Вторую и третью (подопытные) формировали из больных аденовирозом телят. У телят диагностировали ларингофарингиты и бронхиты, симптомов поражения желудочнокишечного тракта не наблюдали.

Телят второй и третьей групп лечили с применением симптоматических средств и антибиотика цефтонина (для подавления секундарной микрофлоры) по соответствующим инструкциям. Телятам второй группы вводили рекомбинантный бычий интерферон (БелАгроГен, Беларусь) в до-зе1,0 см3 на 10 кг массы один раз в сутки в течение семи суток по инструкции. Рекомбинантный бычий интерферон (RecIFb) содержал 10 тыс. единиц интерферона в 1,0 см3. Телятам третьей (подопытной) группы вводили RecColE2 в дозе 5 мл (500 мкг) внутримышечно один раз в сутки в течение семи суток. На 1-е и на 10-е сутки у животных всех групп исследовали кровь на показатели клеточного иммунитета.

Количество лейкоцитов в крови телят, фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс определяли в соответствие с методическими рекомендациями по оценке и коррекции иммунного статуса животных [9].

Уровень цитокинов интерлейкина-1 α (IL-1α), интерлейкина-4 (IL-4) и количество маркерного рецептора CD282 определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) диагностикумами Clon Coud Со (США) и Cusabio Biotech Co (Китай) на иммуноферментном анализаторе Zenyth 340 («Anthos», Китай).

Количество в крови дефензинов β1 (DEFβ1) и дефензинов β2 (DEFβ2) определяли методом ИФА диагностикумами Clon Cloud Co (США) и Agilent Technologies (США).

Статистическую обработку данных проводили по программе Statistica [10].

Результаты и обсуждения

На первые сутки исследования у телят второй и третьей подопытных групп отмечали снижение аппетита, депрессию, слизистые истечения из носовой полости, сухой кашель и повышение температуры до 41-41,50С. Из смывов носовой полости и бронхиального лаважа на культурах клеток ЛЭК (легкие эбриона коровы) и MDBK (Madin Darby Bull Kidney) с последующей идентификацией в РИФ (реакции иммуно-флюоросценции) и ИФА был выделен и типирован аденовирус крупного рогатого скота 2 типа (Adv2).

В крови больных телят второй и третьей групп не наблюдали увеличения количества лейкоцитов, но констатировали повышение фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса, что указывало на усиление фагоцитарной активности популяции лейкоцитов без количественного ее увеличения (таблица). Отмечали резкое повышение провоспалительного цитокина IL-1α, вырабатываемого лейкоцитами и эпителием бронхов и вызывающего воспаление и лихорадку. Количество IL-1α в крови телят третьей (подопытной) группы, по сравнению показателями первой (контрольной) группы, повысилось с 39,82±0,86 до 420,91±1,22 пг/мл (Р<0,05). Повышение уровня провоспалительных цитокинов в крови больных телят второй и третьей групп вызывало ускоренное высвобождение больших количеств ключевого ингибитора воспаления IL-4, который усиливал иммунный ответ и подавлял экспрессию IL-1α (таблица). Повреждение эпителия бронхов и у больных телят вызвало каскад цитокиновых реакций, с увеличением в 13 раз по сравнению с показателями крови в контрольной группе, CD282-маркера мембранного белка Toll-подобного рецептора 2 (TLR-2), обеспечивающего функционирование врожденного иммунитета от вирусных антигенов. Увеличение в крови маркерного белка CD282 с 1,26±0,14 (первая группа контрольная) до 17,12±0,18 нг/мл (третья группа подопытная) показало, что процесс взаимодействия аденовирусного паттерна идет через ТLR-2 паттерн распознающий рецептор. Не наблюдалось значительного повышения в крови телят второй и третьей групп катионного пептида DEFβ1-фактора врожденной резистентности организма. DEFβ1 блокировал вирусные рецепторы и взаимодействовал с клетками бронхиального эпителия, но отсутствие его количественного увеличения не повлияло на развитие вирусного процесса. В крови животных второй и третьей групп отмечали повышение DEFβ2 с 16,8±0,92 до 387,56±0,28 (Р<0,05), что указывало на активацию воспалительного процесса в организме направленного на ингибирование вируса [11, 12].

Таблица. Действие рекомбинантного колицина Е2 на некоторые факторы иммунитета телят при аденовирозе

* P<0,05 – 2-я и 3-я группы по отношению к контролю на 1-е сутки;

** P<0,05 – 2-я группа по отношению к контролю на 10-е сутки;

*** P<0,05 – 3-я группа по отношению ко 2-й группе на 10-е сутки.

На восьмые сутки у телят второй и третьей подопытных групп отмечали нормализацию температуры, отсутствие симптомов аденовироза и отрицательные результаты в РИФ и ИФА у всех животных третьей группы. У 40% телят второй группы констатировали выделение из бронхиального лаважа и идентификацию Аdv2.

На десятые сутки у животных всех трёх групп брали кровь на исследование некоторых факторов клеточного иммунитета. Терапия с использованием RecIFb снижала количество лейкоцитов в крови телят второй группы с 8,62±0,08 до 7,32±0,34 109/л без заметного снижения фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса (таблица). Провоспалительный цитокин IL-1α снижался незначительно с 420,91±1,22 до 361,42±0,98 пг/мл, количество IL-4 в крови практически осталось на прежнем уровне первых суток исследования.

После курса лечения RecIFb количество DEFβ1 в крови не изменилось, а уровень DEFβ2 оставался высоким (таблица). Повышенное количество IL-1α, IL-4 и DEFβ2 в крови телят второй группы указывало на неполную компенсацию клеточного иммунитета после заболевания и на возможность рецидивов аденовирусной инфекции.

В крови телят третьей (подопытной) группы после курса терапии с применением Rec ColE2 отмечали нормализацию значений фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса в связи с подавлением инфекционного процесса в эпителии трахеи и бронхов и снижении пролиферации лейкоцитов (таблица) [13, 14]. Принимая во внимание Toll-зависимую рецепторную транслокацию колицинов и активацию TLR-2 системы под воздействием Rec ColE2 для распознавания генома Adv2, отмечали снижение CD282 с 17,12±0,18 до 1,86±0,29 нг/мл в связи с подавлением репликации вируса [15]. Кроме того RecColE2 в процессе лечения активировал DEFβ2, который ингибировал раскрытие вируса и проникновение эндосомального белка Adv2 в клетки эпителия бронхов путем связывания капсида в области пептонов [16]. При прекращении воспалительного процесса и полной элиминации вируса показатели DEFβ2, IL-1α, IL-4 в крови телят третьей группы снизились до физиологической нормы.

Заключение

В результате выполненных исследований установлено, что воспалительная реакция на эпителиальные клетки бронхов больных аденовирозом телят идет по TLR2

типу, при этом повышались фагоцитарная активность лейкоцитов, показатели цитокинов IL-1α, IL-4 и уровень DEFβ2 в крови больных телят. Было продемонстрировано выраженное иммунопротективное дей- ствие RecColE2 на клеточный иммунитет организма телят. Полученные результаты подтверждают активацию DEFβ2 и его влияние на подавление репликации Adv2.