Сравнительное действие рекомбинантного колицина Е2 на некоторые факторы клеточного иммунитета при аденовирозе телят
Автор: Азямов М.А.
Журнал: Международный журнал гуманитарных и естественных наук @intjournal
Рубрика: Сельскохозяйственные науки
Статья в выпуске: 10-4 (85), 2023 года.
Бесплатный доступ
Исследовано сравнительное действие рекомбинантного колицина Е2 (RecColE2) на некоторые показатели клеточного иммунитета при аденовирозе телят. Установлено, что RecColE2 и интерферон бычий рекомбинантный (RecIFb) через 10 дней терапии купировали симптомы заболевания. При применении RecColE2 на десятые сутки в крови телят констатировали снижение до физиологического уровня показатели количества интерлейкинов IL-1α, IL-4, дефензина DEFβ2 и маркера мембранных белков CD282.
Аденовирус 2 типа, дефензины, интерлейкины, интерферон, колицин е2, телята, фагоцитарная активность
Короткий адрес: https://sciup.org/170201960
IDR: 170201960 | DOI: 10.24412/2500-1000-2023-10-4-70-74
Текст научной статьи Сравнительное действие рекомбинантного колицина Е2 на некоторые факторы клеточного иммунитета при аденовирозе телят
Аденовирусные инфекции диагностируются в популяциях крупного рогатого скота во всем мире [1, 2]. Аденовирусы обладают высокой устойчивостью к химическим детергенам и физическим воздействиям, а также при репликации в организме животных и людей могут образовывать внутриядерные включения из вирусных вирионов в виде агломератов кристаллоподобного строения [3, 4].
Аденовирусы строго специфичны, но геном аденовируса 2 типа у крупного рогатого скота на 92% сходен с геномом аденовируса 2 типа человека. При исследнии альтернативного сплайсинга аденовируса 2 типа установлено продуцирование более девятисот типов М-РНК (мессенджерных рибонуклеиновых кислот), кодирующих синтез вирусных белковых компонентов, подавляющих гуморальный и клеточный иммунитет организма животных [5, 6].
В связи с актуальностью изучения действия биологически активных препаратов для лечения телят при аденовирусной инфекции целью нашего исследования являлось изучение сравнительного действия рекомбинантного колицина Е2 (патент №2188233 от 2708.2002, ТУ 9337-01000008064-01) [7, 8] и рекомбинантного интерферона бычьего (БелАгроГен, Беларусь) на некоторые факторы клеточного иммунитета организма телят больных аде-новирозом.
Материалы и методы
Сравнительное действие рекомбинантного колицина Е2 (RecColE2) на некоторые факторы клеточного иммунитета изучали на телятах 3-4-недельного возраста. Были сформированы 3 группы по 10 телят в каждой. Первую (контрольную) группу составляли здоровые телята. Вторую и третью (подопытные) формировали из больных аденовирозом телят. У телят диагностировали ларингофарингиты и бронхиты, симптомов поражения желудочнокишечного тракта не наблюдали.
Телят второй и третьей групп лечили с применением симптоматических средств и антибиотика цефтонина (для подавления секундарной микрофлоры) по соответствующим инструкциям. Телятам второй группы вводили рекомбинантный бычий интерферон (БелАгроГен, Беларусь) в до-зе1,0 см3 на 10 кг массы один раз в сутки в течение семи суток по инструкции. Рекомбинантный бычий интерферон (RecIFb) содержал 10 тыс. единиц интерферона в 1,0 см3. Телятам третьей (подопытной) группы вводили RecColE2 в дозе 5 мл (500 мкг) внутримышечно один раз в сутки в течение семи суток. На 1-е и на 10-е сутки у животных всех групп исследовали кровь на показатели клеточного иммунитета.
Количество лейкоцитов в крови телят, фагоцитарный показатель и фагоцитарный индекс определяли в соответствие с методическими рекомендациями по оценке и коррекции иммунного статуса животных [9].
Уровень цитокинов интерлейкина-1 α (IL-1α), интерлейкина-4 (IL-4) и количество маркерного рецептора CD282 определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) диагностикумами Clon Coud Со (США) и Cusabio Biotech Co (Китай) на иммуноферментном анализаторе Zenyth 340 («Anthos», Китай).
Количество в крови дефензинов β1 (DEFβ1) и дефензинов β2 (DEFβ2) определяли методом ИФА диагностикумами Clon Cloud Co (США) и Agilent Technologies (США).
Статистическую обработку данных проводили по программе Statistica [10].
Результаты и обсуждения
На первые сутки исследования у телят второй и третьей подопытных групп отмечали снижение аппетита, депрессию, слизистые истечения из носовой полости, сухой кашель и повышение температуры до 41-41,50С. Из смывов носовой полости и бронхиального лаважа на культурах клеток ЛЭК (легкие эбриона коровы) и MDBK (Madin Darby Bull Kidney) с последующей идентификацией в РИФ (реакции иммуно-флюоросценции) и ИФА был выделен и типирован аденовирус крупного рогатого скота 2 типа (Adv2).
В крови больных телят второй и третьей групп не наблюдали увеличения количества лейкоцитов, но констатировали повышение фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса, что указывало на усиление фагоцитарной активности популяции лейкоцитов без количественного ее увеличения (таблица). Отмечали резкое повышение провоспалительного цитокина IL-1α, вырабатываемого лейкоцитами и эпителием бронхов и вызывающего воспаление и лихорадку. Количество IL-1α в крови телят третьей (подопытной) группы, по сравнению показателями первой (контрольной) группы, повысилось с 39,82±0,86 до 420,91±1,22 пг/мл (Р<0,05). Повышение уровня провоспалительных цитокинов в крови больных телят второй и третьей групп вызывало ускоренное высвобождение больших количеств ключевого ингибитора воспаления IL-4, который усиливал иммунный ответ и подавлял экспрессию IL-1α (таблица). Повреждение эпителия бронхов и у больных телят вызвало каскад цитокиновых реакций, с увеличением в 13 раз по сравнению с показателями крови в контрольной группе, CD282-маркера мембранного белка Toll-подобного рецептора 2 (TLR-2), обеспечивающего функционирование врожденного иммунитета от вирусных антигенов. Увеличение в крови маркерного белка CD282 с 1,26±0,14 (первая группа контрольная) до 17,12±0,18 нг/мл (третья группа подопытная) показало, что процесс взаимодействия аденовирусного паттерна идет через ТLR-2 паттерн распознающий рецептор. Не наблюдалось значительного повышения в крови телят второй и третьей групп катионного пептида DEFβ1-фактора врожденной резистентности организма. DEFβ1 блокировал вирусные рецепторы и взаимодействовал с клетками бронхиального эпителия, но отсутствие его количественного увеличения не повлияло на развитие вирусного процесса. В крови животных второй и третьей групп отмечали повышение DEFβ2 с 16,8±0,92 до 387,56±0,28 (Р<0,05), что указывало на активацию воспалительного процесса в организме направленного на ингибирование вируса [11, 12].
Таблица. Действие рекомбинантного колицина Е2 на некоторые факторы иммунитета телят при аденовирозе
п/ |
Показатели |
1-е сутки |
10-е сутки |
||||
Первая группа контрольная n=10 здоровые |
Вторая группа контрольная n=10 RecIFb |
Третья группа подопытная n=10 RecColE2 |
Первая группа контрольная n=10 здоровые |
Вторая группа контрольная n=10 RecIFb |
Третья группа подопытная n=10 RecColE2 |
||
1. |
Лейкоциты, 109/л |
8,45±0,06 |
8,62±0,08 |
7,96±0,05 |
8,38±0,09 |
7,32±0,34 |
8,12±0,92 |
2. |
Фагоцитарный показатель, % |
34,2±0,4 |
58,8±0,6* |
57,3±0,8* |
32,8±0,5 |
52,9±0,4 |
36,8±0,7 |
3. |
Фагоцитарный индекс |
4,3±0,12 |
6,9±0,42 |
6,4±0,58 |
4,6±0,14 |
6,2±0,88 |
4,8±0,24 |
4. |
Il-1α, пг/мл |
39,82±0,86 |
420,91±1,22* |
431,15±1,16* |
41,40±0,75 |
361,42±0,98** |
42,52±0,76*** |
5 |
Il-4, пг/мл |
18,56±0,94 |
156,24±0,82* |
168,13±0,95* |
17,48±0,86 |
161,15±1,24 |
18,14±0,98 |
6. |
CD282, нг/мл |
1,26±0,14 |
16,55±0,24* |
17,12±0,18* |
1,14±0,21 |
15,58±0,62** |
1,18±0,15*** |
7. |
DEFβ1, пг/мл |
1,34±0,11 |
1,58±0,22 |
1,46±0,21 |
1,38±0,18 |
1,62±0,48 |
1,86±0,29 |
8. |
DEFβ2, пг/мл |
16,8±0,92 |
460,71±1,15* |
387,56±0,28* |
15,9±0,47 |
380,49±0,83** |
18,25±0,99*** |
* P<0,05 – 2-я и 3-я группы по отношению к контролю на 1-е сутки;
** P<0,05 – 2-я группа по отношению к контролю на 10-е сутки;
*** P<0,05 – 3-я группа по отношению ко 2-й группе на 10-е сутки.
На восьмые сутки у телят второй и третьей подопытных групп отмечали нормализацию температуры, отсутствие симптомов аденовироза и отрицательные результаты в РИФ и ИФА у всех животных третьей группы. У 40% телят второй группы констатировали выделение из бронхиального лаважа и идентификацию Аdv2.
На десятые сутки у животных всех трёх групп брали кровь на исследование некоторых факторов клеточного иммунитета. Терапия с использованием RecIFb снижала количество лейкоцитов в крови телят второй группы с 8,62±0,08 до 7,32±0,34 109/л без заметного снижения фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса (таблица). Провоспалительный цитокин IL-1α снижался незначительно с 420,91±1,22 до 361,42±0,98 пг/мл, количество IL-4 в крови практически осталось на прежнем уровне первых суток исследования.
После курса лечения RecIFb количество DEFβ1 в крови не изменилось, а уровень DEFβ2 оставался высоким (таблица). Повышенное количество IL-1α, IL-4 и DEFβ2 в крови телят второй группы указывало на неполную компенсацию клеточного иммунитета после заболевания и на возможность рецидивов аденовирусной инфекции.
В крови телят третьей (подопытной) группы после курса терапии с применением Rec ColE2 отмечали нормализацию значений фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса в связи с подавлением инфекционного процесса в эпителии трахеи и бронхов и снижении пролиферации лейкоцитов (таблица) [13, 14]. Принимая во внимание Toll-зависимую рецепторную транслокацию колицинов и активацию TLR-2 системы под воздействием Rec ColE2 для распознавания генома Adv2, отмечали снижение CD282 с 17,12±0,18 до 1,86±0,29 нг/мл в связи с подавлением репликации вируса [15]. Кроме того RecColE2 в процессе лечения активировал DEFβ2, который ингибировал раскрытие вируса и проникновение эндосомального белка Adv2 в клетки эпителия бронхов путем связывания капсида в области пептонов [16]. При прекращении воспалительного процесса и полной элиминации вируса показатели DEFβ2, IL-1α, IL-4 в крови телят третьей группы снизились до физиологической нормы.
Заключение
В результате выполненных исследований установлено, что воспалительная реакция на эпителиальные клетки бронхов больных аденовирозом телят идет по TLR2
типу, при этом повышались фагоцитарная активность лейкоцитов, показатели цитокинов IL-1α, IL-4 и уровень DEFβ2 в крови больных телят. Было продемонстрировано выраженное иммунопротективное дей- ствие RecColE2 на клеточный иммунитет организма телят. Полученные результаты подтверждают активацию DEFβ2 и его влияние на подавление репликации Adv2.
Список литературы Сравнительное действие рекомбинантного колицина Е2 на некоторые факторы клеточного иммунитета при аденовирозе телят
- Гаффаров Х.З. Ретроспективный анализ респираторно-кишечных вирусов, циркулирующих среди поголовья крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2013. - Т. 216. - С. 78-84.
- Lehmkuhl H.D., Habbs L.A. Serologic and hexon phylogenetic analysis of ruminant adenoviruses // Arch. Virol. - 2008. - № 153. - P. 891-897.
- Chapron C.D. Detection of astroviruses, enteroviruses and adenoviruses types 40 and 41 in surface waters collected and evaluated by the information collection rule and integrated cell culture-nested PCR procedure // Applied and Environmental Microbiology. - 2000. - № 66. -P. 2520-2525.
- Romanowski E.G., Gordon Y.J., Araullo-Cruz T. The antiviral resistance and replication of cidofovir-resistant adenovirus variants in the New Zealand white rabbit ocular model // Invest Ophtalmol Vis Sci. - 2001. - V. 42. № 8. - P. 1812-1815.
- Li R, Gao S, Chen H, Zhang X, Yang X, Zhao J, Wang Z. Virus usurps alternative splicing to clear the decks for infection. Virol J. 2023 Jun 20, №20 (1):131. doi: 10.1186/s12985-023-02098-9.
- Chow LT, Broker TR, Lewis JB. 1979. Complex splicing patterns of RNAs from the early regions of adenovirus-2. J Mol Biol 134:265-303. doi:10.1016/0022-2836(79)90036-6.
- Азямов М.А., Тихонов И.В., Девришов Д.А. Получение гибридного колицина Е2 // Ветеринарная медицина. - 2002. - №1. - С. 13. - [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.veterinarymedicine.ru/num1-2002.html.
- Азямов М.А. Штамм бактерий B.subtilis pbColE2 - продуцент гибридного колицина Е2, используемый для получения ветеринарного препарата. Патент №2188233 от 27.08.2002.
- Методические рекомендации по оценке и коррекции иммунного статуса животных // Под ред. Шахова А.Г. - Воронеж, 2005. - 115 с.
- Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М.: МедиаСфера. 2002. - 312 с.
- Luenser K., Ludwig A. Variability and evolution of bovine beta-defensin genes // Genes Immun. - 2005. - №6 (2). - P. 115-22. DOI: 10.1038/sj.gene.6364153.
- Islam S., Akhand M., Hasan M. Evolutionary trend of bovine P-defensin proteins toward functionality prediction: A domain-based bioinformatics study // Heliyon. - 2023. - № 9 (3). -P. e14158. DOI: 10.1016/j.heliyon.2023.e14158.
- Азямов М.А., Воронин Е.С., Тихонов И.В., Девришов Д.А., Маслов С.А., Зверьков Д.А. Изучение биологических свойств гибридного колицина Е2, полученного с использованием питательных сред из непищевого сырья // Тезисы докл. Всероссийской науч.-практич. конф., посвящ. 30-летию ВНИТИБП. - Щелково, М.: РСХА, 2001. - С. 356357.
- Sharma O., Zakharov S.D., Zhalnina M.V., Yamashita E., Cramer W.A. Handbook of Biologically Active Peptides // Academic Press. - 2013. - P. 93-100. DOI: ORG/10.1016/B978-0-12-385095-9.00017-8.
- Gratia J.P. Colicins in the Encyclopedia of Genetics // Academic Press. - 2001. - P. 417418. DOI: Org/10.1006/Rwgn.2001.0245.
- Smith J.G., Silvestry M., Lindert S., Lu W., Nemerow G.R., Stewart Ph.L. Insight into the mechanisms of adenovirus capsid disassembly from studies of defensin neutralization // PLoS Pathog. - 2010. - № 6 (6). - P. e1000959. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000959.