Сравнительное изучение семени баранов романовской породы и породы Lori Bakhtiari

Среди множества сравнительных преимуществ производства шерсти и других продуктов животноводства в условиях Ирана следует отметить возможность поддерживать и разводить разные породы домашних животных, что повышает прибыльность и выводит Иран в число лидирующих стран в этой отрасли. Задача иранских научных учреждений, связанных с селекцией животных, заключается в получении кроссбредных форм с целью более полного использования генетического потенциала существующих пород и повышения устойчивости поголовья. Значительное улучшение свойств должно проявляться уже в первом поколении. Преимущественное развитие того или иного направления овцеводства определяется потребностями экономики и возможностями, которые обеспечиваются природно-климатическими условиями. Для территорий, где важнее развивать производство шерсти, необходимо создавать породы шерстного направления продуктивности. Там, где экономически более целесообразно мясное овцеводство, должны использоваться породы с высокой скоростью роста, эффективной конверсией корма и высокими мясными качествами (1). Единственный приемлемый и обоснованный способ обеспечить прибыльное овцеводство — это полное использование продуктивного потенциала животных (2).

Романовская овца — русская порода, выведенная в XVIII веке (первое упоминание — 1802 год), которая в 1963 году впервые была ввезена во Францию в INRA (French National Institute for Agricultural Research) для исследовательских целей. Породу отличает быстрое созревание и такие выдающиеся характеристики, как высокая частота рождения двоен, сильный материнский инстинкт овцематок и крепкое физическое состояние новорожденных ягнят. Согласно породному стандарту, животные имеют

^∗ Работа поддержана Iranian TTLU (грант KA93-95). 318

достаточно длинные конечности. Еще один важный признак — высокая резистентность и жизнеспособность овец-матерей и ягнят. Окот проходит легко. Живая масса романовских баранов и овец в среднем составляет соответственно 55-80 и 40-50 кг. Бараны проявляют агрессивное поведение в период размножения и половую активность во все сезоны года (3).

Lori-Bakhtiari — сильная порода, которая выделяется продуктивными качествами в условиях Ирана. Этих овец разводят на юго-западе страны, в основном в провинции Chaharmahal Bakhtiari. Главное место выращивания — именно Chaharmaahal Bakhtiari, но благодаря выдающимся качествам породу также разводят в соседних провинциях — Isfahan, Lorestan, Kohgiloye и Boyerahamd, Khuzistan. Эти овцы известны у кочевников Haft Lang. У породы длинный и толстый жирный хвост, что делает ее привлекательной для разведения и распространения. Хвост разделен надвое (рис. 1). Иногда конец жирного хвоста достигает нижних скакательных суставов (3).

Рис. 1. Бараны местной иранской породы Lori-Bakhtiari (слева) и кроссбредное животное F 1 (справа). Очень длинный жирный хвост, характерный для породы, в потомстве от скрещивания значительно укорочен.

Под воздействием инсоляции у романовских баранов уменьшается объем эякулятов, общая и индивидуальная подвижность сперматозоидов, их концентрация и жизнеспособность в нормальной сперме. Длина и диаметр яичек у баранов романовской породы больше, чем у сверстников локальных финских пород (4). Цвет эякулята зависит от концентрации спермы: при высокой он кремовый, при низкой — изменяется на белый, сперма становится водянистой (5). Показана прямая зависимость между числом живых спермиев в эякуляте и эффективностью оплодотворения (частотой наступления беременности) (6).

Чтобы уменьшить проявление некоторых признаков, характерных для Lori-Bakhtiari (например, длинный жирный хвост и низкий процент двоен), планируется получить гибриды этой породы с романовской овцой (7). Согласно проекту, предполагается скрестить романовских баранов с овцами Lori-Bakhtiari (см. рис. 1). Однако данные о морфологических особенностях семени у двух пород в условиях Ирана отсутствуют.

Целью этого исследования было сравнение показателей качества семени (объем, концентрация, подвижность, морфометрические параметры сперматозодилов) у обеих пород.

Методика . Баранов выращивали на Исследовательской станции Ja-had Keshavarzi Organization (провинция Chaharmahal Bakhtiari) в одинаковых условиях кормления и содержания. Достигшие 2-3-летнего возраста 24 самца (по 12 каждой породы) поступили на исследовательскую станцию Shuli, принадлежащую Jahad Keshavarzi Organization (Chaharmahal Bakhtiari), географические координаты: 50 ° в.д., 32 ° с.ш., высота над уровнем моря

2017 м. Сперму отбирали на искусственную вагину и передавали в лабораторию для анализа, сохраняя при температуре 36 ° C, чтобы предотвратить холодовой шок.

Для определения подвижности сперматозоидов свежеполученную сперму разбавляли средой Hepes TCM 199 (Tissue Culture Medium) («Sigma-Aldrich, Inc.», США) в соотношении 1:250. Из разбавленного образца отбирали 5 мкл и помещали в счетную камеру Makler Counting Chamber ( « New York Microscope Company, Inc.», США) для исследования микроскопированием в системе с программным обеспечением CASA (Computer-aided sperm analysis). Для изучения морфологии спермиев готовили мазки, которые окрашивали, используя набор реактивов Rapid Sperm Staining (RSS) Differentiation quick kit. Набор содержит растворы А, В и С. Раствор А наслаивали на мазок таким образом, чтобы полностью покрыть его поверхность. Через 75 с раствор А удаляли и вместо него наносили раствор В на 60 с, затем его удаляли раствор С помещали на 15 с на мазок, после чего препараты промывали в медленно текущей проточной воде. Мазки полностью высушивали при комнатной температуре. После окрашивания, используя программное обеспечение Isc для удерживания изображения, просматривали примерно 100 спермиев в одном поле зрения микроскопа при увеличении ½40. Регистрировали набор параметров (площадь, периметр, продольный и поперечный диаметры головки, размеры разных частей тела спермия и жгутика).

Рассчитывали средние ( M ), стандартные ошибки средних (±SE) и статистическую значимость (Р) различий между изучаемыми показателями у двух пород.

Рис. 2. Сперматозоиды барана породы Lori Bakhtiari (увеличение ½20).

Результаты . На рисунке 2 представлен образец спермы барана Lori-Ba-khtiari при 20-кратном увеличении.

Мы сравнили морфологические характеристики и подвижность сперми-ев у двух пород. Различные показатели спермы и спер-миев романовских баранов и животных породы Lori-Bakhtiari приведены в таблице 1.

Морфологические показатели, включая боль шой и малый диаметр, периметр (мк) и площадь (мк2) головки спермия представлены в таблице 2. Также определяли длину жгутика (мк), средней и задней части тела спермия. Результаты сравнения морфологии сперматозоидов у двух пород выявили статистически значимые различия (P < 0,01) в большом диаметре и площади головки. В то же время у баранов обеих пород не различались малые диаметры и периметры головки спермиев. Различия по длине хвостовой части и средней части тела сперматозоида оказались статистически значимыми, тогда как различия в длине задней части тела спермия отсутствовали (см. табл. 2).

Изучая A, B, C и D типы подвижности спермиев, оценивали фактическую скорость перемещения сперматозоидов, прямолинейно-пост-320

упательное движение и его среднюю скорость (мк/с), средний угол вращения, максимальную боковую подвижность (мк), частоту боковых колебаний (Hz), процент поступательных движений, процент угла поворота и стандартный процент прямолинейных движения (табл. 3).

• 1.    Спермопродукция у изученных баранов романовской породы и породы Lori Bakhtiari (Исследовательская станция Shuli, Chaharmahal Bakhtiari, Иран)

  Порода	Возраст, лет	Цвет барана	¹ барана	¹ повторности образца	Цвет эякулята	Концентрация спермиев, ½1012/мл
  Lori Bakhtiari	3,0	Белый	885954	1	Бежевый	2,2
  Lori Bakhtiari	2,5	Белый	917163	1	Бежевый	1,6
  Lori Bakhtiari	2,5	Белый	865821	1	Бежевый	1,0
  Lori Bakhtiari	2,5	Белый	917163	2	Бежевый	1,5
  Lori Bakhtiari	2,5	Белый	865821	2	Бежевый	1,8
  Lori Bakhtiari	3,0	Белый	885954	2	Бежевый	2,0
  Lori Bakhtiari	3,0	Белый	885954	3	Бежевый	1,9
  Lori Bakhtiari	2,5	Белый	917163	3	Бежевый	1,6
  Lori Bakhtiari	2,5	Белый	865821	3	Бежевый	1,6
  Lori Bakhtiari	2,5	Белый	865586	1	Бежевый	1,6
  Lori Bakhtiari	2,5	Белый	865586	2	Бежевый	1,5
  Lori Bakhtiari	2,5	Белый	865586	3	Бежевый	1,6
  Романовская	2,0	Черный	50202	1	От бежевого до белого	1,8
  Романовская	2,0	Черный	50202	2	От бежевого до белого	1,5
  Романовская	2,0	Черный	50202	3	От бежевого до белого	1,6
  Романовская	2,0	Черный	52028	1	От бежевого до белого	1,7
  Романовская	2,0	Черный	52028	2	От бежевого до белого	1,6.
  Романовская	2,0	Черный	52028	3	От бежевого до белого	1,7
  Романовская	2,0	Черный	52017	1	От бежевого до белого	1,6
  Романовская	2,0	Черный	52017	2	От бежевого до белого	1,4
  Романовская	2,0	Черный	52017	3	От бежевого до белого	1,6
  Романовская	2,0	Черный	50141	1	От бежевого до белого	1,8
  Романовская	2,0	Черный	50141	2	От бежевого до белого	1,5
  Романовская	2,0	Черный	50141	3	От бежевого до белого	1,6

• 2.    Морфологические характеристики спермиев у романовских баранов и баранов породы Lori-Bakhtiari ( M ±SE, Исследовательская станция Shuli, Cha-harmahal Bakhtiari, Иран)

  Показатель	Lori-Bakhtiari	Романовская	P
  Большой диаметр головки, мк	8,10±0,37	9,16±0,37	0,000
  Малый диаметр головки, мк	4,63±0,33	4,77±0,41	0,130
  Периметр головки, мк	24,29±1,50	24,47±0,97	0,570
  Площадь головки, мк2	26,97±1,18	24,89±1,94	0,000
  Длина жгутика, мк	56,11±1,90	57,59±1,50	0,007
  Длина средней части тела, мк	14,11±1,10	15,40±1,20	0,000
  Длина задней части тела, мк	42,01±2,60	42,19±2,10	0,750

• 3.    Сравнительная характеристика спермы у романовских баранов и баранов породы Lori-Bakhtiari ( M ±SE, Исследовательская станция Shuli, Chaharmahal Bakhtiari, Иран)

  Показатель	Lori-Bakhtiari	Романовская	P
  Концентрация сперматозоидов, ½106/мл	5308,8±0,15	6764,4±1,2	0,028
  Подвижных спермиев, %	39,24±0,80	59,47±1,60	0,048
  Спермиев с поступательным движением, %	33,55±0,42	52,37±2,10	0,042
  Спермиев с подвижностью класса А, %	21,47±1,10	38,26±1,20	0,320
  Спермиев с подвижностью класса B, %	12,07±1,90	14,11±0,60	0,490
  Спермиев с подвижностью класса С, %	5,68±1,90	7,09±1,60	0,290
  Спермиев с подвижностью класса D, %	60,76±0,34	40,53±0,72	0,048
  Фактическая скорость сперматозоидов, мк/с	38,87±0,42	58,95±1,70	0,019
  Прямолинейное движение, мк/с	24,12±1,40	41,08±0,30	0,027
  Средняя скорость прямолинейного движения, мк/с	27,87±1,60	45,82±0,36	0,025
  Средний угол вращения, °	9,27±1,60	15,17±1,50	0,047
  Максимальный диапазон боковых колебаний, мк	1,72±1,40	2,23±1,90	0,030
  Частота боковых колебаний, Hz	0,41±0,22	0,74±0,36	0,022
  Доля линейных движений, %	36,63±0,65	48,26±2,00	0,086
  Угол вращения, %	50,15±0,72	60,49±1,50	0,089
  Стандартная поступательная подвижность, %	52,79±1,20	63,29±1,60	0,069

Сравнение средних показателей по каждой породе показало, что концентрация спермиев, доля подвижных спермиев, процент спермиев с прямолинейно-поступательным движением, доля сперматозоидов с подвижностью классов A и D, фактическая скорость движения, скорость поступательного движения, средняя скорость поступательного движения, средний угол вращения и частота боковых колебаний у пород статистически значимо (P < 0,05) различались. У обеих пород была выявлена существенная связь между процентом спермиев с подвижностью класса В, класса D, процентом сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением, средним углом вращения, процентом стандартной прямолинейной подвижности (см. табл. 3).

Согласно представленным данным (см. табл. 3), наибольшую концентрацию спермиев в эякуляте имели романовские бараны (6764,4 против 5308,8 млн/мл у сверстников породы Lori-Bakhtiari). Самая высокая доля подвижных сперматозоидов также была характерна для романовской породы (59,47 % против 39,24 %). Наивысший процент поступательных движений спермиев тоже регистрировали у романовских баранов (52,37 % против 33,55 %). Самый высокий процент спермиев с подвижностью класса А имели романовские бараны (38,26 % против 21,47 %). Наибольшую фактическую скорость спермиев отмечали у романовских баранов (58,95 против 38,87 мк/с). Скорость прямолинейного поступательного движения спермиев была самой высокой у животных романовской породы (45,82 против 27,87 мк/с). Самый большой угол вращения наблюдали у животных романовской породы (15,17 против 9,27 ° ). Максимальный диапазон боковых колебаний тоже был выше у романовской породы (2,23 против 1,72 мк) (см. табл. 3).

Морфологические характеристики спермиев оказывают огромное влияние на оплодотворяемость яйцеклетки. В норме не менее чем у 30 % спермиев не должно быть морфологических отклонений (8). Аномалии могут проявляться в разных формах. Например, спермии могут иметь две головки, два жгутика, возможна микроцефалия сперматозоидов. Аномальные спермии неспособны к сбалансированному движению и оплодотворению яйцеклетки (9). В нашем эксперименте некоторые морфологические нарушения, например изогнутые хвосты спермиев, наблюдали у романовских баранов.

Цвет спермы служит одним из важнейших индикаторов ее оплодотворяющей способности. У баранов и быков он изменяется от светложелтого до кремового. С увеличением концентрации спермиев эякулят становится кремовым, при низкой — практически неокрашенным, водянистым (5). В выполненном нами эксперименте сперма у баранов Lori-Bakhtiari имела кремовый цвет (5,3½1012/мл), у романовских — была белесой (6,7½1012/мл).

Подвижность спермиев — наиболее значимый фактор фертильности, определяющий их продвижение в репродуктивном тракте самки. Поэтому подвижность спермиев и оплодотворяющая способность спермы взаимосвязаны. Увеличение процента прямолинейно-поступательных движений повысит фертильность спермы. Мы не выявили у пород статистически значимую связь в отношении подвижности классов B и C (P < 0,05), тогда как по подвижности классов A и D она оказалась существенной. У спер-миев романовских баранов подвижность класса А была выше, чем у баранов Lori-Bakhtiari (P > 0,05). Применение некоторых агентов и режимов воздействия может повлиять на подвижность спермиев. Так, при использовании мелатонина вне периода размножения (10) существенно изменяло показатели подвижности сперматозоидов у баранов Lori-Bakhtiari. В дру- гом исследовании (11) изучали профили лютеинизирующего гормона (luteinizing hormone, LH), фолликулостимулирующего гормона (folliclestimulating hormone, FSH) и тестостерона у романовских и французских баранов. Результаты показали, что поступление в кровь FSH у пород не различалось, тогда как секреция LH и тестостерона у романовских самцов была выше и начиналась раньше. По-видимому, лучшая воспроизводительная способность у романовской породы обусловлена освоенностями секреции гонадотропинов и тестостерона (12). Сравнение подвижности спермиев в свежеполученной сперме и спермы после 24 ч сохранения in vitro показало, что в первом случае этот показатель значительно выше. Уменьшение подвижности до значений ниже 20 % снижает ее оплодотворяющую способность. У быков подвижные спермии составляют 50-80 %. Исследования показали, что подвижность высока в начале исследования, но в течение короткого промежутка времени процент подвижных сперми-ев снижается (13). Тем не менее, у некоторых бесплодных быков подвижность спермиев высока. У фертильных баранов подвижность спермиев 6070 %, а у спермиев с аномалиями тела или жгутика подвижность низкая (14). В нашем опыте у романовских баранов доля подвижных сперматозоидов была выше (59,47 % против 39,24 %). Учитывая минимальную подвижность 60-70 % спермиев у баранов Lori-Bakhtiari, можно предположить их низкую фертильность. Еще один показатель, определенный с использованием системы CASA, указывал на превосходство романовских баранов. Фактическая скорость, доля прямолинейных продвижений, скорость с прямолинейном направлении (мк/с), средняя скорость поступательного движения, средний угол вращения (степень), максимальный боковые отклонения (мк), частота боковых движений (Hz), процент линейной подвижности, средний процент угла вращения и нормированный процент прямолинейно-поступательной подвижности у романовских баранов были выше (P > 0,05), чем у баранов породы Lori-Bakhtiari.

Морфометрическое изучение половых клеток, особенно спермиев, очень важно при оценке породных характеристик. Для таких исследований применяют различные методы. Так, J. Yaniz с соавт. (15) применили окрашивание и флуоресцентную микроскопию для выявления особенностей акросомы и ядра в сперматозоидах барана. В первой группе читаемые цифровые изображения спермиев, головки и ядра были получены при окрашивании иодидом калия. Изображения анализировали с использованием компьютерной программы CASA. Во второй группе применили краситель Хехст (Hoechst) для окрашивания ядрышек спермиев с последующей обработкой в программе CASA. Значимых связей при этом не выявили. С использованием системы CASA выполнялись измерения головок сперми-ев и анализ полученных данных. Для длины и ширины головки, отношения ширины к длине, величины площади и периметра были получены значения соответственно 8,08 мк, 4,80 мк, 0,59, 29,13 мк2 и 23,93 мк (16). Окрашивание с помощью КI применяли для сравнения ядер спермиев у быков, хряков и баранов. Морфометрическое изучение показало, что у бараньих спер-миев акросомы длинные и широкие, а у бычьи — маленькие (17). В нашем исследовании у романовских баранов большой и малый диаметры головки спермиев, периметр и площадь головки, длина хвоста, длина средней и задней части составили соответственно 9,16±0,37 мк, 4,77±0,41 мк, 24,47±0,97 мк, 24,89±1,94 мк2, 57,59±1,50 мк, 15,40±1,20 мк и 42,19±2,10 мк. Сравнение морфометрических данных, представленных в таблице 2, показало, что площадь головки спермия у романовских баранов статистически значимо больше (P > 0,01), чем у баранов Lori-Bakhtiari. Длина средней части также значительно больше. Согласно данным таблицы 2, подвижность спермиев у романовских баранов выше, чем у Lori-Bakhtiari. Вероятно, у романовских баранов вследствие удлиненной средней части спер-мия в нем аккумулируется больше митохондрий. Благодаря такой структуре обеспечивается больше энергии для движения сперматозоидов.

Таким образом, на основании сравнения классов подвижности спермиев у романовских баранов и баранов породы Lori-Bakhtiari можно предположить, что повышение подвижности класса А у романовской породы обусловлено удлиненной средней частью сперматозоида с большим количеством митохондрий. По другим свойствам спермиев проведенное нами исследование также установило превосходство романовских баранов над баранами породы Lori-Bakhtiari.

Авторы благодарят Исследовательскую станцию Shuli (провинция Chahama-hal Bakhtiari) за помощь в сборе образцов.