Сравнительное изучение серологической активности нативных и синтетического антигенов вируса лейкоза крупного рогатого скота

В Российской Федерации в структуре заболеваемости крупного рогатого скота (КРС) лейкоз занимает первое место [14]. Экономический ущерб, причиняемый энзоотическим лейкозом, обусловлен недополучением молочной и мясной продукции, преждевременной выбраковкой больных и зараженных коров и быков-производителей, затратами на проведение ветеринарно-санитарных и зоотехнических мероприятий. Для неблагополучных по лейкозу КРС племенных хозяйств устанавливают ограничения в реализации, переводу племенных животных в категорию товарных [4, 11, 12].

В мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционных болезней животных, в том числе и лейкоза КРС основное место занимает своевременная, достоверная диагностика, а также изоляция больных и подозрительных в заболевании животных от здоровых [1, 10]. Основными методами диагностики лейкоза КРС являются серологические – реакция иммунодиффузии (РИД), иммуноферментный анализ (ИФА) [3]. С помощью серологических тестов выявляют специфические антитела к структурным белкам вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС), таким как гликопротеин вирусной оболочки – gp51 и нуклеокапсидный белок – p24. Известно, что антитела против gp51 появляются раньше и имеют более высокий титр [2].

В качестве антигенного составляющего во многих серологических тест-системах используются антигены, полученные из культуры клеток почек овцы, хронически инфицированной возбудителем лейкоза крупного рогатого скота (FLK BLV). Очистка антигенов ВЛ КРС от культуры FLK BLV является трудоемким процессом. К тому же антигены ВЛ КРС, полученные из культуры FLK BLV, часто имеют перекрестную реакцию с антителами других видов животных. Это объясняется наличием других белковых примесей в их составе, в частности сыворотки крови КРС и клеточных белков культуры FLK [7, 9].

В последние годы в серологической диагностике широко применяются рекомбинантные и синтетические аналоги антигенов возбудителей инфекционных болезней животных [8, 13]. Синтетические антигенные компоненты по чувствительности и специфичности не уступают нативным антигенам [15]. Иммуногенные пептиды ВЛ КРС, полученные синтетическим путем, представляют интерес и для разработки средств специфической профилактики лейкоза КРС [17].

Целью исследования являлась сравнительная оценка серологической активности синтетического пептида и нативных антигенов ВЛ КРС.

Материал      и      методы исследований.  Синтетический пептид

BLVpep                     (N-конец

NCKYSNQCGDQGSFYVNHQILFLHLKQ CHGIFTLTWEIWNC конец-С) был разработан на основании аминокислотной последовательности белка gp51 в позиции от 131 до 163 аа. (GenBank: ABS11217.1). Специфичность пептида BLVpep была проверена с использованием онлайн-утилиты BLASTр интернет-ресурса NCBI [16].

нормативно-правовым актам: ГОСТ 340882017 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила

содержания

и

ухода

за

сельскохозяйственными

животными»

(действует с 01.08.2018); Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 г. № 79 «Об утверждении правил надлежащей клинической практики Евразийского экономического союза»; Приказ Минздрава РФ от 01.04.2016 г. № 199 н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Исследования проводились

Работа животными

схеме, представленной на

лабораторными

с согласно рисунке 1.

вели согласно следующим

Рисунок 1 – Общая схема эксперимента. Примечание: НАК FLK BLV – нативный

антигенный комплекс из FLK BLV

Антигены gp51, p24 ВЛ КРС были получены из FLK BLV и очищены методом скоростного центрифугирования, как было описано ранее [6]. Также исследовали НАК FLK BLV.

Для получения антител против нативных антигенов (НАК FLK BLV, gp51, p24) ВЛ КРС использовали шесть кроликов-самцов породы Советская шиншилла в возрасте 6 мес., массой тела 2,0-3,0 кг. Перед иммунизацией кролики находились в карантинном помещении, во время которого вели клиническое наблюдение за ними. Животных иммунизировали двумя очищенными антигенами gp51, p24 а также отдельно НАК FLK BLV, который состоял из эпитопов капсидной оболочки ВЛ КРС. Кроликов разделили на три равные группы, по две головы в каждой. Животных первой группы иммунизировали НАК FLK BLV, второй – gp51, третьей – p24.

Гиперммунизацию осуществляли по схеме Байлей [5]. Кровь у кроликов отбирали на 30, 45, 60, 75 и 90 сут после первой иммунизации с последующим отделением сыворотки.

Серологическую активность исследуемых антигенов изучали методом твердофазного неконкурентного ИФА. Для постановки ИФА использовали иммунологические планшеты производства АО «Фирма Медполимер»

(Россия). Концентрация всех антигенов для сенсибилизации составила 1 мкг /мл. Для НАК FLK BLV, gp51, p24 в качестве буфера применяли карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (КББ) рН 9,5, для пептида BLVpep – фосфатносолевой буфер (ФСБ) рН 7,2. Инкубацию планшетов осуществляли при температуре от 2 °С до 8 °С в течение 16 ч, после чего содержимое лунок промывали на вошере « Thermofisher» (США) один раз ФСБ (рН7,3) с добавлением 0,05 % детергента Твин-20 (ФСБ-Т). В качестве блокирующего буфера применяли 3 % раствор сухого молока на ФСБ в количестве 200 мкл на лунку с инкубацией при 300 об. / мин. при 37 °С в течение 2 ч. После инкубации планшет отмывали один раз ФСБ-Т. Исследуемые сыворотки и антивидовой конъюгат против IgG КРС (ООО фирма «Имтек», Россия) разводили на ФСБ-Т (в соответствии с инструкцией) и инкубировали 45 мин при 37 °С. После окончания инкубации с сыворотками планшет промывали 3 раза, конъюгатом – 5 с ФСБ-Т. В качестве субстрата применяли раствор пероксида водорода с хромогеном тетраметилбензидин (ТМБ) (ООО фирма «Имтек», Россия). Остановку ферментативной реакции проводили с использованием 1М раствора серной кислоты. Оптическую плотность (ОП) образцов измеряли на спектрофотометре Multiskan GO («ThermoFisher», США) при длине волны 450 нм.

За коэффициент позитивности (КП) принималось отношение оптической плотности (ОП) исследуемого образца к ОП контрольной отрицательной сыворотки. КП является универсальным показателем, применяемым в иммуноферментных тестах.

Также для определения сравнительной серологической активности исследуемых антигенов использовали специфическую преципитирующую сыворотку КРС из набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ФКП «Курская биофабрика-фирма «БИОК») и отрицательную сыворотку КРС, для которой ранее было подтверждено наличие/ отсутствие антител к возбудителю лейкоза методом РИД [3].

Статистическую обработку цифровых данных осуществляли по t -критерию Стьюдента.

Результат исследований.

Серологическая активность антигена оказывает значительное влияние на чувствительность и специфичность ИФА. В связи с чем перед нами стояла задача изучить сравнительную серологическую активность синтетического и нативных антигенов ВЛ КРС. Используя современные методы биоинформатики, нами был разработан синтетический пептид (BLVpep), аминокислотная последовательность которого соответствовала иммуногенным эпитопам гликопротеина gp51 ВЛ КРС. Также из культуры FLK BLV были получены и очищены антигены gp51 и p24. Именно эти антигены в основном вырабатываются антитела [9]. Кроме того, для исследования серологической активности был взят НАК FLK BLV. Для контроля серологической активности нативных антигенов, проводили иммунизацию кроликов очищенными препаратами gp51, p24 и НАК FLK BLV. В результате предварительного исследования гипериммунных сывороток нативными антигенами и пептидом BLVpep установили, что наиболее высокую активность показала сыворотка крови кроликов, иммунизированных НАК FLK BLV. Для дальнейших исследований данная сыворотка была взята за основу, в качестве репера. Результаты определения серологической активности изучаемых антигенов с гипериммунными сыворотками кроликов в различные сроки иммунизации представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, на всех сроках исследования наибольшая серологическая активность была установлена у пептида BLVpep – ОП при разведении сыворотки 1:25 составила 1,348 ед. Самую низкую серологическую активность показал НАК FLK BLV, что, по-видимому, связано наличием в его составе белковых примесей клеточного и сывороточного происхождения [7].

Наибольшая динамика накопления специфических к исследуемым антигенам антител у кроликов была отмечена с 30 по 60 сут. В промежутке с 75 по 90 сут иммунизации динамика антителообразования замедлялась. После 90 сут эксперимента проводили тотальное обескровливание кроликов.

Как было сказано раньше, на чувствительность ИФА оказывает большое влияние антигенный компонент. Чем выше серологическая активность антигена, тем выше чувствительность ИФА. Одним из показателей оценки активности антигена в ИФА является определение коэффициента позитивности (КП), который представляет собой отношение ОП исследуемой сыворотки к ОП контрольной отрицательной сыворотки. На рисунке 2 представлены результаты определения КП сывороток крови кроликов при использовании нативных антигенов и пептида BLVpep при твердофазном непрямом ИФА. Сыворотки исследовали на 90 сут иммунизации.

Таблица 1 – Серологическая активность нативных антигенов и гипериммунных сывороток крови кроликов

Срок исследования	1 группа (НАК FLK BLV)	2 группа (gp51)	3 группа (p24)	BLVpep
Через 30 дней	0,457±0,05	0,503±0,08	0,481±0,08	0,715±0,05
Через 45 дней	0,682±0,09	0,735±0,04	0,719±0,06	0,903±0,03
Через 60 дней	0,911±0,04	1,015±0,08	0,986±0,02	1,325±0,06
Через 75 дней	0,929±0,08	1,067±0,05	0,993±0,04	1,339±0,07
Через 90 дней	0,945±0,07	1,093±0,06	1,017±0,05	1,348±0,04

Рисунок 2 – Коэффициент позитивности сывороток крови у иммунизированных кроликов при исследовании с антигенами ВЛКРС в ИФА на 90 сут иммунизации

Установили, что КП гипериммунной сыворотки кролика при использовании в качестве антигена пептида BLVpep в разведениях с 1:25 по 1:1600 составил больше 2. Таким образом, минимальный титр антител, выявляемый антигеном BLVpep равен 1:1600.

Результаты сравнительных серологических исследований специфической преципитирующей сыворотки КРС и отрицательной по РИД сыворотки крови КРС в ИФА подтвердили специфичность полученных антигенов и высокую чувствительность метода с антигеном    BLVpep.    Коэффициент позитивности     при     применении специфической       преципитирующей сыворотки КРС представлен на рисунке 3.

Рисунок 3 – Коэффициент позитивности специфической преципитирующей сыворотки крови КРС при исследовании с антигенами ВЛКРС в ИФА

Установлено, что минимальный титр антител, выявляемый пептидом BLVpep составил 1:1600, НАК FLK BLV – 1:400, gp51 – 1:800, p24 – 1:800. Для пептида BLVpep КП в разведениях с 1:25 по 1:1600 был выше 2. Также отмечена корреляция значений КП при исследовании специфической преципитирующей сыворотки КРС и гипериммунных сывороток кроликов.

Заключение. В данной работе была изучена серологическая активность НАК FLK BLV, gp51, p24 и пептида BLVpep ВЛ КРС c гипериммунными сыворотками кроликов. Установлено, что в течение всего эксперимента при исследовании сывороток крови кроликов и КРС наибольшая серологическая активность была установлена у пептида BLVpep. Самую низкую серологическую активность показал НАК FLK BLV, что предположительно обусловлено недостаточной его чистотой. Минимальный титр антител, выявляемый пептидом BLVpep составил 1:1600, gp51 и p24 – 1:800, НАК FLK BLV – 1:400. Таким образом, BLVpep – антиген, представляющий собой синтетический пептид, разработанный на основе наиболее иммуногенных эпитопов гликопротеина gp51, обладает высокой серологической активностью и может быть использован для диагностических исследований.