Сравнительный анализ бактериального сообщества рубца у молодых и взрослых особей Rangifer tarandus из арктических регионов России в летне-осенний период

Северный олень (Rangifer tarandus) — уникальный вид, специфически приспособленный к жизни в условиях Севера, в связи с чем оленеводство служит стратегически важной отраслью животноводства в арктических

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда для реализации научного проекта ¹ 17-76-20026 «Микробиоценоз рубца Rangifer tarandus Арктических регионов России как фундаментальная основа получения перспективных биотехнологий для сельскохозяйственных животных».

регионах России, обеспечивающей население продовольствием. Рацион северных оленей имеет значительные сезонные различия. В летне-осенний период его основу составляют почти 300 видов растений, включая злаки, осоки, листья ив, карликовых берез. На долю лишайников приходится до 15 %. В зимне-весенний период она возрастает до 70 %, а остальные 30 % представляют остатки зеленых растений, мхи, различные примеси (1, 2).

Усвоение растительных кормов у северных оленей происходит, как и у других жвачных, благодаря ферментам, продуцируемым симбионтами рубца. Известно, что рубец северных оленей населен симбиотическими микроорганизмами: бактериями, грибами, археями, простейшими (3-5). Его микробное сообщество может отражать как региональные особенности кормового пастбищного рациона, так и общее физиологическое состояние животных. По современным оценкам, разнообразие микроорганизмов в рубце жвачных достигает нескольких тысяч видов, но детально изучены менее 100. Большинство из них строго анаэробные некультивируемые виды (6-9), поэтому наиболее информативными методами исследования микробного сообщества рубца служат молекулярно-генетические, направленные на изучение его структуры в целом, — NGS-секвенирование (nextgeneration sequencing) и T-RFLP-анализ (terminal restriction fragment length polymorphism). Они позволяют детектировать и определять содержание низкопредставленных микроорганизмов в сообществе рубца, что продемонстрировано в исследованиях на крупном рогатом скоте (КРС) (10, 11), овцах (12, 13), оленях (14), козах (15, 16).

На сегодняшний день микробиоценоз рубца северного оленя наименее изучен среди жвачных, хотя его анализ представляет значительный интерес в связи с оценкой адаптационно-физиологических и анатомических приспособлений организма к неблагоприятным условиям ареала и условиям питания этого вида. Опубликованы единичные работы по молекулярно-генетическому анализу микробиоценоза рубца северных оленей, обитающих на территории Норвегии (14, 17), а также микрофлоры рубца других представителей семейства Cervidae — пятнистых оленей (18, 19).

В настоящей работе мы впервые выполнили молекулярно-генетические исследования микробиома рубца северных оленей, обитающих на территории двух зон Арктической России, — Мурманской области и Ямало-Ненецкого автономного округа. Показаны значимые различия в составе бактериального сообщества рубца в зависимости от региона и возраста животных. Наибольшие возрастные изменения выявлены в составе филума Firmicutes . Прямой закономерности, характеризующей возрастные изменения содержания в рубце патогенных микроорганизмов, не обнаружено.

Цель работы заключалась в сравнительной оценке таксономического состава бактериального сообщества рубца молодых и взрослых особей Rangifer tarandus из разных мест обитания в летне-осенний период.

Методика. Объектом исследования были молодые (возраст 1-2 года) и взрослые особи (3-6 лет) северных оленей ненецкой породы. Образцы содержимого рубца отбирали в летне-осенний период в 2017 году от 3 животных из каждой возрастной группы в Ямало-Ненецком автономном округе (АО) (п.г.т. Харп, лесотундровая природно-климатическая зона) и Мурманской области (ст. Лопарская, тундровая природно-климатическая зона).

Состав бактериального сообщества рубца анализировали методом Т-RFLP (20). Общую ДНК из образцов выделяли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва) согласно рекомендациям производителя. ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе Verity («Life Technologies, Inc.», США) с помощью эубактериальных праймеров 356

63F (3´-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-5´) с меткой на 5´-конце (флуорофор WellRed D4, «Beckman Coulter», США) и 1492R (3´-TACGGHTAC-CTTGTTACGACTT-5´). Амплификацию фрагментов гена 16S pРНК осуществляли в следующем режиме: 3 мин при 95 °С (1 цикл); 30 с при 95 °С, 40 с при 55 °С, 6о с при 72 °С (35 циклов); 5 мин при 72 °С. Конечную концентрацию тотальной ДНК в растворе определяли на флуориметре Qubit («Invitrogen, Inc.», США) с использованием наборов Qubit dsDNA BR Assay Kit («Invitrogen, Inc.», США) согласно рекомендациям производителя.

Флуоресцентно меченные ампликоны гена 16S pРНК очищали по стандартной методике (21). Рестрикцию 30-50 нг ДНК проводили с использованием HaeIII, HhaI и MspI, следуя рекомендации изготовителя

(«Fermentas, Inc.», Литва), в течение 2 ч при 37 °С. Продукты рестрикции осаждали этанолом, затем добавляли 0,2 мкл маркера молекулярной массы Size Standart-600 («Beckman Coulter», США) и 10 мкл формамида Sample Loading Solution («Beckman Coulter», США). Анализ проводили с помощью CEQ 8000 («Beckman Coulter», США), погрешность прибора составляла не более 5 %. Размеры пиков и их площадь вычисляли в программе Fragment

Analysis («Beckman Coulter», США), выделяли подтипы (филотипы) с принятой в исследовании погрешностью в 1 нуклеотид и рассчитывали их относительную долю в микробном сообществе. Принадлежность бактерий к определенной таксономической группе определяли с использованием базы данных .

Результаты обрабатывали методом дисперсионного анализа, используя пакет программ Microsoft Excel 2010. В таблицах представлены средние (M) и ошибки средних (±SEM). Достоверность различий между средними значениями исследуемых показателей оценивали с помощью t- критерия Стьюдента. Коэффициенты биоразнообразия Шеннона и Симп- сона рассчитывали в программе Past .

Результаты. Данные об усредненном составе летнего пастбищного рациона северных оленей представлены в таблице 1.

1. Усредненный состав (%) летнего пастбищного рациона северного оленя ( Rangifer tar-andus ) в двух зонах Арктической России

Компонент рациона I II Лишайники Cladonia 10 5 Лишайники Nephroma 5 Ива северная Sаlix borеalis 20 5 Ива полярная Salix polaris 15 Голубика Vaccinium uliginosum 10 Береза карликовая Bеtula nаna 20 25 Береза обыкновенная Betula pendula 20 5 Смесь многолетних трав 30 30 П р и м е ч а н и е. 1 — cтанция Лопарская, Мурманская область (лесотундра), 2 — Харп, Ямало-Ненецкий автономный округ (тундра). Прочерки означают, что компонент в рационе отсутствовал.

В первые годы жизни у северных оленей наблюдается наибольший падеж, что, вероятно, обусловлено скудностью рациона в условиях природно-климатических зон обитания (22, 23).

Использованные нами праймеры позволяют ампли-фицировать фрагмент гена 16S pРНК с позициями от 63-й до 1492-й (нумерация указана для гена 16S pРНК Esherichia coli ).

С помощью молекулярно-генетического метода T-RFLP в бактериальном сообществе рубца Rangifer tarandus было выявлено значительное количество филотипов, общее число которых составляло от 106,0±4,70 до 163,0±7,20 в зависимости от возраста и региона обитания животных (табл. 2). В течение онтогенеза этот показатель изменялся. Максимальное количество филотипов обнаружили в образцах, отобранных у молодых особей в Мурманской области (Р < 0,05), тогда как у животных из Ямало-Ненецкого АО наблюдалась обратная закономерность (Р < 0,05).

Показатели индекса биоразнообразия Шеннона и индекса домини- рования Симпсона для северных оленей из Ямало-Ненецкого АО были достоверно более высокими (Р < 0,05), то есть у них неоднородность бактериального сообщества рубца оказалась выше, чем у животных из Мурманской области. У молодняка оленей из Ямало-Ненецкого АО отмечали достоверно меньшие (Р < 0,05) показатели биоразнообразия по сравнению со взрослыми особями, что свидетельствует о меньшем накоплении энтропии, большей степени организации и однородности состава бактериального сообщества. У Rangifer tarandus из Мурманской области показатели биоразнообразия в течение онтогенеза существенно не изменялись (см. табл. 2).

• 2.    Показатели биоразнообразия бактериального сообщества рубца у молодых (возраст 1-2 года) и взрослых (3-6 лет) особей северного оленя ( Rangifer tarandus ) из Мурманской области (I) и Ямало-Ненецкого автономного округа (II) ( M ±SEM, 2017 год)

• 3.    Соотношение бактериальных таксонов в содержимом рубца у молодых (возраст 1-2 года) и взрослых (3-6 лет) особей северного оленя ( Rangifer taran-dus ) из Мурманской области (I) и Ямало-Ненецкого автономного округа (II) ( M ±SEM, 2017 год)

  Встречаемость, %	I		II
  	молодые	взрослые	молодые	взрослые
  Фила Bacteroidetes	8,20±0,38	3,89±0,13*	18,32±0,84	13,45±0,64*
  Фила Firmicutes	17,00±0,75	46,59±2,08*	35,93±1,63	48,65±1,96*
  класс Clostridia	9,08±0,40	32,52±1,65*	15,12±0,65	26,86±1,21*
  семейство Thermoanaerobacteraceae	2,42±0,11	1,11±0,04*	0,24±0,01	0,12±0,01
  семейство Lachnospiraceae	0,52±0,03	6,83±0,31*	2,30±0,10	2,72±0,35
  семейство Eubacteriaceae	1,30±0,05	16,90±0,74*	9,47±0,34	15,34±0,48*
  семейство Ruminococcaceae	1,16±0,04	0,80±0,03*	0,19±0,01
  cемейство Clostridiaceae	3,68±0,17	5,16±0,19*	2,61±0,20	8,36±0,38*
  род Peptococcus		1,72±0,07	0,31±0,02	0,32±0,01
  род Lactobacillus	4,16±0,19	4,71±0,27	2,66±0,12	1,12±0,06*
  род Bacillus	1,56±0,06	5,97±0,24*	4,37±0,25	5,03±0,22
  род Staphylococcus	0,14±0,01	0,86±0,04*	0,10±0,01	0,31±0,02*
  класс Negativicutes	2,06±0,08	2,53±0,14	13,68±0,54	15,33±0,63
  Фила Actinobacteria	15,65±0,78	4,47±0,17*	12,20±0,52	7,91±0,30*
  род Bifidobacterium	0,25±0,02	0,15±0,01*	1,09±0,06	0,21±0,02*
  прочие	15,40±0,65	4,32±0,16*	11,11±0,36	7,70±0,21*
  Фила Proteobacteria	7,63±0,29	13,11±0,63*	4,34±0,21	13,49±0,34*
  семейство Enterobacteriaceae	0,64±0,03	7,59±0,12*	1,83±0,09	1,00±0,04*
  семейство Сampylobacteriaceae	6,08±0,28	3,04±0,10*	1,30±0,05	9,69±0,35*
  семейство Pseudomonadaceae	0,91±0,03	1,94±0,43*	0,32±0,05	0,48±0,02
  семейство Burkholderiaceae		0,29±0,01	0,89±0,04	2,32±0,08*
  семейство Succinivibrionaceae		0,25±0,01
  Фила Tenericutes (род Mycoplasma )	0,82±0,02	1,48±0,04*
  Фила Fusobacteria	1,05±0,04	0,97±0,06	0,18±0,01	1,65±0,05*
  Фила Cyanobacteria			0,70±0,03	0,75±0,02
  Фила Acidobacteria			0	0,33±0,01
  Неклассифицированные последовательности	49,65±3,35	29,49±1,32*	28,33±1,12	13,77±0,95*

Показатель	I		II
	молодые	взрослые	молодые	взрослые
Индекс биоразнообразия Шеннона	2,89±0,32	2,61±0,23	5,40±0,18*	7,12±0,25*
Индекс биоразнообразия Симпсона	0,74±0,03	0,74±0,02	0,88±0,03*	0,90±0,04*
Количество филотипов, ед.	150,0±5,40	106,0±4,70	109,5±4,15	163,0±7,20

П р и м еч а ни е. Описание групп см. в разделе «Методика».

* Региональные различия статистически значимы при Р < 0,05.

П р и м еч а ни е. Описание групп см. в разделе «Методика». Прочерки означают, что значения находились ниже достоверного определения методом T-RFLP.

* Различия между взрослыми и молодыми особями в пределах одного региона статистически значимы при Р < 0,05.

По результатам оценки таксономической принадлежности большинство выявленных филотипов было отнесено к четырем бактериальным филумам — Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria и Proteobacteria, суммарная доля которых в содержимом рубца северных оленей составляла в зави- симости от возраста и региона обитания от 48,48±4,19 до 83,50±5,07 % (табл. 3). В меньшей степени в сообществе рубца оказались представлены бактерии филумов Tenericutes и Fusobacteria, Acidobacteria, Cyanobacteria. Значительную часть филотипов (от 13,77±0,95 до 49,65±3,35 %) не удалось идентифицировать и отнести к определенному таксону, что указывает на необходимость дополнительных исследований для установления их функционального значения в физиологических процессах.

Полученные результаты в целом соответствуют современным представлениям о микробиоте рубца как жвачных в целом (8, 20, 24), так и северных оленей (14, 17). Например, ранее сообщалось о большем количестве неидентифицированных таксонов в рубце у северных оленей Rangifer tarandus tarandus, обитающих в Норвегии по сравнению с крупным рогатым скотом и газелями Томпсона (5).

Процентное содержание представителей Eubacteriaceae и Clostridi-aceae из класса Clostridia , обладающих целлюлозо- и сахаролитическими свойствами, у исследованных нами особей Rangifer tarandus также было значительно выше, чем сообщалось для наиболее изученных жвачных семейства Bovidae , в частности для КРС (8, 20, 24). По мнению исследователей, указанные анаэробные микроорганизмы, в частности Eubacterium ran-giferina , у северных оленей обеспечивают процессы детоксикации уснино-вой кислоты и других вторичных метаболитов, продуцируемых лишайниками родов Cladonia , Usnea , Lecanora , Ramalina , Evernia , Parmelia , Alectoria (25-27). Считается, что благодаря особенностям микробного сообщества рубца северных оленей потребление значительного количества лишайников в зимний период (до 70 % в общем составе рациона) не оказывает токсического действия на северных оленей (в отличие от лосей или овец). Так, сообщалось о массовом падеже более 300 лосей вследствие употребления лишайников при отсутствии альтернативного корма (25).

Упоминалось о присутствии в рубце северных оленей микроорганизмов из филума Cyanobacteria (17), что представляется вполне закономерным, поскольку цианобактерии относятся к симбионтам лишайников. Наиболее часто цианобионтами лишайников оказываются представители рода Nostoc , в меньшей степени — родов Calothrix , Scytonema и Fischerella (28). Количество цианобактерий у исследованных нами особей из ЯмалоНенецкого АО было минорным, тогда как у животных из Мурманской области оно оказалось ниже предела достоверного определения методом T-RFLP, что, вероятно, связано с региональными особенностями летнего пастбищного рациона северных оленей.

В возрастных изменениях структуры микробиома у северных оленей из различных регионов Арктики мы выявили ряд сходных тенденций. Так, общее процентное содержание неидентифицированных бактериальных филотипов у взрослых особей было гораздо ниже (Р < 0,05), чем у молодых. Наибольшие возрастные изменения среди идентифицированных таксонов отмечались для филума Firmicutes . В рубце у взрослых особей общее содержание микроорганизмов класса Clostridia , особенно представителей семейств Eubacteriaceae , Clostridiaceae и Lachnospiraceae , обладающих потенциальной способностью к гидролизу углеводов растительных кормов с образованием летучих жирных кислот, было достоверно выше по сравнению с молодыми (Р < 0,05). Обратную закономерность отммечали в отношении бактерий с аналогичными свойствами из филума Bacteroidetes (в том числе родов Bacteroides , Prevotella ), которые ферментируют крахмал, клетчатку, некоторые другие углеводы, белки и дезаминируют аминокислоты.

Интересно отметить практически полное отсутствие в рубце у ис- следуемых особей целлюлозолитических бактерий семейства Ruminococca-ceae, которых в значительном количестве выявляют в рубце у крупного рогатого скота (8, 20, 24).

Численность бактерий класса Negativicutes , способных утилизировать образуемые в результате сбраживания моносахаров, олиго- и полисахаридов кислоты (включая уксусную, пропионовую, масляную, молочную и др.) у взрослых особей имело некоторую тенденцию к увеличению по сравнению с молодыми. Ранее присутствие в рубце значительного количества селеномонад (в том числе Selenomonas ruminantium ), которые отличались по внешнему виду и разнообразию от встречающихся у КРС, описано Б.В. Таракановым (7). Сообщалось, что утилизирующие кислоты бактерии родов Megasphaera , Selenomonas , Dialister — физиологически значимая группа для КРС, поскольку они не позволяют накапливаться в рубце лактату, повышение доли которого может приводить к снижению рН и инициировать развитие лактатного ацидоза (7, 20, 29). Следует отметить достоверно меньшую долю (Р < 0,05) представителей кислотообразующих бактерий рода Lactobacillus и достоверно большую (Р < 0,05) — утилизирующих кислоты видов класса Negativicutes у особей из Ямало-Ненецкого АО по сравнению с животными из Мурманской области. Выявленные различия, вероятно, связаны с региональными особенностями летнего пастбищного рациона северных оленей тундровой природно-климатической зоны в Мурманской области и лесотундровой — в Ямало-Ненецком АО.

В сообществе рубца были широко представлены условно-патогенные микроорганизмы, большинство из которых традиционно связывают с развитием гастроэнтеритов, — бактерии семейств Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae . Высокой оказалась доля актиномицетов филума Actinobacteria (семейства Coriobacteriaceae , Corynebacterium ), среди которых могут встречаться возбудители актиномикозов, характеризующихся поражением различных органов и тканей (20). Среди бактерий, вызывающих инфекционные заболевания, были детектированы возбудители кампилобактериоза (семейство Campylobacteraceae ), пастереллеза (семейство Pasteurellaceae ), микоплазмоза (филум Tenericutes ), некробактериоза (филум Fusobacteria ), гнойно-некротических инфекций (род Staphylocoссus ). Содержание перечисленных патогенов у исследованных особей было минорным, за исключением энтеробактерий, актинобактерий, кампилобактерий и фузобакте-рий. В северном оленеводстве достаточно полно охарактеризованы только проблемы, связанные с развитием некробактериоза, поскольку он может стать причиной массовой гибели молодняка. Показано, что у КРС возбудитель некробактериоза Fusobacterium necrophorum способен проникать в кровь и инфицировать организм с развитием абсцессов печени, поражений копыт, кожи, слизистых (22, 23, 29).

Прямой закономерности, характеризующей возрастные изменения содержания в рубце патогенных микроорганизмов, в том числе филума Fusobacteria , семейств Сampylobacteriaceae , Enterobacteriaceae , у исследованных особей северного оленя мы не выявили. Вероятно, детектированные различия в представленности перечисленных патогенных и условнопатогенных микроорганизмов были связаны с особенностями пастбищного рациона и эпизоотической ситуацией в стаде, что требует уточнения в дополнительных исследованиях.

Таким образом, результаты молекулярно-генетического анализа методом T-RFLP свидетельствуют о заметных изменениях бактериального сообщества в рубце у северных оленей в течение онтогенеза и различиях в его составе у животных, обитающих на территории Мурманской области и Ямало-Ненецкого автономного округа. В целом более 80 % выявленных 360

микроорганизмов относилось к четырем бактериальным филумам — Fir-micutes , Bacteroidetes , Actinobacteria и Proteobacteria . Менее представленными оказались Tenericutes , Fusobacteria , Acidobacteria и Cyanobacteria. Общее биоразнообразие микроорганизмов было достоверно выше (Р < 0,05) у особей из Ямало-Ненецкого АО по сравнению с животными из Мурманской области. Отмечены сходные тенденции в изменении состава бактерий, потенциально способных гидролизовать углеводы растительных кормов, при этом прямой закономерности, характеризующей возрастные изменения содержания в рубце патогенных микроорганизмов, не выявлено. Полученные данные позволяют углубить имеющиеся сведения о физиологии северного оленя, обитающего в условиях Арктической России. Эти результаты могут быть использованы в качестве основы для создания рекомендаций для повышения эффективности разведения северных оленей и снижения падежа животных.