Сравнительный анализ морфо-физиологических особенностей проростков Triticum vulgare после воздействия наночастиц металлов

Чрезвычайное разнообразие наночастиц металлов (НЧМ) и других наноматериалов привело к широкому их использованию в промышленности, сельском хозяйстве, биологии и медицине. НЧМ вызывают биологический ответ, отличающийся от действия традиционной ионной формы элементов. Некоторые из них в небольших дозах менее токсичны, чем металлы в ионной форме [1, 2].

В обширном перечне имеющейся литературы в области нанотехнологий существенное место отводится оценке биологических эффектов НЧМ на растения, а именно ростовым показателям и биохимическим показателям [1–5].

В связи с тем, исследование механизмов биологического влияния НЧМ с позиции изменения ряда физиолого-биохимических параметров актуально для более полного понимания адаптационных возможностей растительных организмов к техногенным наноматериалам.

Цель работы – комплексное исследование физиолого-биохимических механизмов устойчивости и/или чувствительности проростков Triticum vulgare к наночастицам металлов.

Материалы и методы

Объектом исследования послужили семена пшеницы мягкой Triticumvulgare Vill., соответствующие 1 классу. В качестве материала исследования были выбраны коммерчески доступные нанопорошки Ni˚ (ООО «Передовые порошковые технологии», г.Томск) и Сu˚(ООО «Плазмотерм», г. Москва) диаметром 57±1,15 нм и 54± 2,06 нм, соответственно.

Содержание фотосинтетических пигментов (ФП) определяли в этанольном экстракте из листьев спектрофотометрическим методом по стандартной методике [6] с видоизменениями [1]. Уровень внутриклеточного содержания активных форм кислорода (АФК) устанавливали по интенсивности флуоресценции 0,25 мкМ 2,7-дихлородигидрофлуоресцеин диацетата (DСFН-DA), в качестве положительного контроля использовали 35 мкМ Н 2 О 2 [5, 7]. Определение гидроксильного радикала НО проводили по флуоресценции 7-гидроксикума-рин-3-карбоновой кислоты (7-OH-ККК) [9], положительным контролем служил реактив Фентона– 50 мкМ СuSО 4 и 25мМ Н 2 О 2 [ 1]. Генерацию супероксид-анион радикала О 2 -в корнях проростков определяли по окислению адреналина при 347 нм, при этом положительным контролем была система генерации О 2 – 0,05 мМ рибофлавин (РФ) и 1мМ тетраметилэтиленди-амин (ТЕМЕД) [1, 8].

Результаты и обcуждение

Интегральная оценка результатов тестирования ИТ по энергии прорастания (Е) и морфо-метрическим характеристикам проростков T. vulgare после 48 часов воздействия НЧ металлов позволила зафиксировать низкую устойчивость растений к Cu˚ и Ni˚. Подсчет энергии прорастания (Е) показал достоверное снижение (Р < 0,05) показателя при внесении в среду проращивания НЧ Cu˚ и Ni˚. При этом, наиболее выраженное влияние на процент прорастания было отмечено для НЧCu˚: в присутствии металла происходило резкое, на порядок бóльшее (по сравнению с контролем) угнетение пророста семян (в 44 раза), вплоть до полного его подавления при концентрациях 0,5 и 1 М. Вместе с тем, в присутствии НЧ Ni˚ в разведениях от 0,1 до 1 М значение Е было ниже контроля в 16,7 раза, соответственно (Р < 0,05).

Развернутый анализ метрических показателей проростков T. vulgare после 48 часов воздействия НЧ металлов и их оксидов показал, что применение НЧ Cu˚ и Ni˚ способствовало уменьшению роста проростков, которое усиливалось с возрастанием концентрации металла в среде культивирования. Особенно это отчетливо видно на примере с НЧCu˚, заметно подавляющих рост первого листа до 11 раз, а корня– до 19 раз по отношению к контролю (P≤0,05). В то же время, НЧ Ni˚ уменьшали рост корня до 7,4 раз по сравнению с контролем, а рост первого листа – до 5,3 раз, соответственно (P<0,05).

Нами также установлено, что Cu˚ и Ni˚ влияли даже на устойчивый к действию большинства металлов процесс заложения латеральных корней [1]. Так, Ni˚ снижал количество боковых корней до 3,4±1,02 шт. (против 4,6± 0,11 шт. в контроле), Cu˚– увеличивала до 6,8± 0,17 шт. Снижение адвентивных корней, вероятно, является общим проявлением специфической реакции растений к металлам [10]. Интересно отметить, что растения, выращенные в присутствии Ni˚ и Cu˚, характеризовались развитием более компактной корневой системой по сравнению с интактными образцами. Причем в вариантах с Cu˚ наблюдалось ветвление по типу «гусиной лапки» и образование растений-«карликов». Похожие результаты по влиянию на ростовые и морфологические параметры корней показаны как на ионных, так и наноформах меди [11].

Итак, на основе ростовых характеристик T. vulgare мы рассчитали ИТ, который в целом был меньше для корневой системы, чем для листьев. Это представляется вполне закономерным, поскольку корень является первичной «мишенью» действия многих металлов (таблица 1).

Таблица 1.

Соотношение фотосинтетических пигментов в листьях проростков T. vulgare после 48-часового воздействия НЧ металлов

Table 1.

The ratio of photosynthetic pigments in the leaves of sprouts T. vulgare after 48-Hourly impact of the LF metals

Концентрация НЧ металлов, М (Concentration NP, M)		Хл. a/b (Chl. a/b)	Хл/Кар (Chl/Car)	Концентрация НЧ металлов, М (Concentration NP, M)		Хл. a/b (Chl. a/b)	Хл/Кар (Chl/Car)
Контроль (Control)		2,68	7,83	Контроль (Control)		2,68	7,83
Cu˚	0,0125	2,27*	5,05	Ni˚	0,0125	2,68	7,88
	0,025	2,03*	4,85		0,025	2,85*	7,27*
	0,05	2,03*	6,33*		0,05	3,57*	6,73*
	0,1	2,22*	6,23		0,1	3,74*	6,65*
	0,5	–	–		0,5	3,51	7,02*
	1	–	–		1	3,97*	6,43*

Примечание:* – вариант достоверно отличающийся от контроля (значение Р ≤ 0,05) Note:* – The variant is reliably different from the control (value p ≤ 0.05)

Анализ содержания фотосинтетических пигментов (ФП) позволил сформировать согласованные представления об избирательности влияния нанометаллов на компоненты пигментной системы проростков, зависящей как от состава металла, так и от его концентрации. На фоне воздействия Cu˚ и Ni˚ отмечалось снижение пула хлорофиллов на 19% и 18,5% соответственно. Детализация подобного ингибирующего эффекта продемонстрировала видоспецифичное влияние указанных металлов на отдельные формы хлорофилла. Так, Cu˚ способствовала уменьшению Хл a (на 22–33% относительно контроля), а Ni˚ в концентрациях более 0,05 М снижал содержание Хл b (на 45,5–81,8%) (Р > 0,05).

Исследование про-/антиоксидантного статуса проростков Triticum vulgare после воздействия наночастиц металлов

Изменение роста корней пшеницы после внесения Cu˚ и Ni˚ определило интерес к более точному анализу прооксидантных эффектов последних. Так, флуориметрическое измерение DСFН-DА позволило констатировать достоверное (Р<0,05) прямопропорциональное увеличение общей суммы АФК в корнях по сравнению с отрицательным контролем после воздействия Сu˚ (до 35,8%). В целом, уровень АФК опытных образцов был на 39% ниже относительно положительного контроля (35 мкМ Н 2 О 2 ). Полученные результаты согласуются с микроскопией апекса корней проростков, согласно которой наиболее выраженная флуоресценция регистрировалась после воздействия Сu˚ в зоне корневого чехлика (рисунок1).

Рисунок 1. Флуоресценция DCF на расстоянии 0,5 см от апекса в отрицательном контроле (А) и после воздействия 0,1 М Сu˚ (Б) и Ni˚ (В), увеличение 40х (бар 50 мкм)

Figure 1. Fluorescence DCF at a distance of 0.5 cm from apex in negative control (a) and after exposure 0.1 m CU˚) и Ni˚ (b), increase 40s (bar 50 microns)

Влияние НЧ металлов на выработку радикалов НО∙ в корневой части T. vulgare заключалось в увеличении интенсивности флуоресцентного сигнала 7-OH-ККК. Так, наиболее выраженное статистически значимое по сравнению с контролем

(Р < 0,05) накопление количества НО зафиксировано при воздействии Сu˚ в дозе 0,05 и 0,1 М (до 8,5 и 13,6%). Несмотря на это, уровень радикалов был ниже, чем после обработки растений реактивом Фентона (на 8,7–12%). В тоже время, наличие в среде Ni˚ в существенной мере не влияло на образование НО∙ радикалов (менее 3%).

Кроме того, обнаружено, что скорость образования О 2 - прогрессивно нарастала после экспозиции с Ni˚ (от 52 до 68% относительно отрицательного контроля). На этом фоне Сu˚ увеличивали выработку О 2 • – в меньшей степени (до 12,5%) (Р < 0,05), что согласуется с динамикой выработки данного радикала, показанной на примере Arabidopsis thaliana [11]. Стоит отметить то, что величина определяемого показателя была более чем в 2 раза ниже, чем у растений, выросших в системе генерации О 2 .

В ходе исследования нами также установлен интенсивный флуоресцентный сигнал 7-ОН-ККК радикалов НО∙ после проращивания T. vulgare с наномедью. Наиболее выраженное статистически значимое (Р < 0,05) накопление количества НО• в корневой части растений по сравнению с контролем наблюдалось при воздействии НЧ Сu˚ в дозе 0,05 и 0,1 М – на 8,5 и 13,6% соответственно. Несмотря на это, уровень радикалов был ниже, чем после обработки растений реактивом Фентона (на 8,7–12%). Наличие в среде СuО и Ni˚ в существенной мере не влияло на образование НО∙радикалов (накопление менее 3%).

Результаты также показали, что скорость образования О 2 – прямопропорционально увеличивается после экспозиции T. vulgare с Ni˚ на 52–68% выше отрицательного контроля (рисунок 2). В тоже время, Сu˚ увеличивала выработку О 2 - в меньшей степени (на 12,5%). Стоит отметить то, что величина определяемого показателя была более чем в 2 раза ниже, чем у растений, выросших в среде системы генерации О 2 . В недавней работе [11] также обнаружено увеличение О 2 - и Н 2 О 2 после воздействия наномеди на примере Arabidopsis thaliana .

ьо

S

*

й

*

й о ф

*

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0 * ,1

Concentration NP, M

Ж Control

^■^ ( Ni˚

^^^^™ ■ Линейная (Control)

♦• Cu˚

X О2∙-

Линейная (О2∙-)

Рисунок 2. Скорость генерации супероксид-аниона О 2 – по аутоокислению адреналина в экстракте из корней проростков T. vulgare после 48-часового воздействия НЧ Сu˚ и Ni˚; * Р ≤ 0,05

Figure 2. Speed of generation of superoxide-anion about 2 – on auto-oxidation of adrenaline in extract from roots of sprouts T. vulgare after 48-Hourly exposure to Cu˚ and Ni˚; * Р ≤ 0.05

Таким образом, модельное растение T. vulgare обладает видоспецифичной чувствительностью к изменениям содержания Сu˚ и Ni˚ в наноформе: Ni˚ стимулирует выработку О 2 -, а Сu˚– общий пул АФК, включающий Н 2 О 2 и НО∙.

Полученные результаты служат дополнительным доказательством существования избирательности при активации той или иной реакции антиоксидантной системы растений, определяемой природой наноматериала. Однако, изменение в уровне АФК в присутствииNi˚ и Сu˚ можно отнести к неспецифической ответной реакции растений, поскольку аналогичные изменения характерны для разнообразных видов стрессов растений и в большинстве случаев требуют дальнейших исследований. В этом аспекте основной «мишенью» действия НЧ металлов оказалась корневая система растений, что определило интерес к выявлению механизмов фитотоксичности с акцентом на исследование клеточного повреждения именно в этой части растений.

Выводы

• 1.    Обнаружено уменьшение устойчивости проростков T. vulgare после воздействия меди и никеля в наноформе, что проявляется снижением энергии прорастания семян и ростовых показателей.

• 2.    Зарегистрировано специфичное снижение общего содержания хлорофилла а (медь) и хлорофилла b (Ni˚) в листьях, что свидетельствует об избирательности ответной реакции