Сравнительный анализ показателей криоконсервированной и свежеполученной спермы баранов-производителей романовской породы

Введение. Важным направлением научнопрактических и научно-исследовательских работ для овцеводства в Российской Федерации является создание современных, продуктивных типов овец, которые соответствуют лучшим породам мирового уровня [1].

Согласно определению В.В. Абонеева, искусственное осеменение – целенаправленное усовершенствование породных и продуктивных качеств в овцеводстве за счет активного использования наиболее ценных баранов-производителей [2]. Результативность искусственного осеменения, а это и высокая оплодотворяемость и плодовитость маток, эффективна лишь тогда, когда правильно проведена работа по подготовке к случке маток баранов-производителей, а самое главное – когда проведены скрининговые мероприятия по проверке генетического материала по всем актуализированным методикам [1].

Оплодотворяющая способность баранов-производителей зависит от комплекса различных бифакторов [3]. Необходимо, чтобы биологическое качество эякулята соответствовало определенным критериям [4]. В результате этого обязательное проведение комплексной оценки спермопродукции необходимо для последующего использования высопродуктивных сельскохозяйственных животных в воспроизводстве [5]. Совместно с классическими методами оценки качества спермы возникает необходимость комплексного подхода к оценке спермопродукции производителей, использования современных методов, а именно определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов и подсчета половых клеток с интактной ак-росомой [6, 7].

Причиной идиопатического бесплодия является содержание большого количества сперми-ев с аномальной акросомой в полученном эякуляте, в случае если в спермограмме диагносци-руется положительные параметры. P. Gottardo объясняет это тем, что в акросоме уменьшается проницаемость плазматической мембраны для ионов кальция, что отражается на их способности прикрепляться к мембране ооцита [8]. В поврежденной дегенеративной акросоме часто наблюдаются выраженные разрушения плазматической мембраны, впоследствии они приводят к низкой оплодотворящей способности сперми-ев баранов-производителей [9]. Отсутствие или повреждение апикального тельца у спермокле-ток проявляется нарушением различных процессов в сперматогенезе.

Митохондриальная дисфункция приводит к нарушению синтеза АТФ и гиперпродукции АФК в сперме, в настоящее время данная патология пополняет группу патологических отклонений у спермиев, которые выражаются чаще всего генетическими, структурными биохимическими дефектами в митохондриях [10, 11].

По данным, представленным С.М. Боруновой (2018 г.), флагманом передовых методов контроля морфофункциональных качеств спермиев является изучение их подвижности и индекса фрагментации ДНК как в головной части, так и в срединной.

Цель исследования. Проведение сравнительной оценки криоконсервированной и свеже-полученной спермы баранов-производителей по морфофункциональным показателям качества семени (подвижность, патологические и ано- мальные формы спермиев, аномальная акро-сома, индекс фрагментации ДНК).

Задачи исследования: провести сравнительную оценку морфологических показателей свежеполученной и криоконсервированной спермы баранов-производителей романовской породы по идентификации аномальных сперматозоидов; установить индекс фрагментации ДНК и митохондриальной дисфункции сперматозоидов в свежеполученной и криоконсервирован-ной сперме баранов-производителей романовской породы.

Материалы и методы. Научные работы исполняли в осенний период 2020 г. на базе кафедры диагностики болезней, терапии, акушерства и репродукции животных МГАВМиБ им. К.И. Скрябина и в лаборатории отдела по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ», по ГОСТ 32277-2013 «Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов». Материалом для исследований послужили пробы свежеполученной и крио-консервированной спермы, полученной от баранов-производителей романовской породы. Всего было исследовано 20 спермопроб от 10 баранов-производителей в трехкратной повторности на определение морфофункциональных показателей спермопродукции. Для изучения качественных характеристик спермы (подвижность, скорость движения, аномальные формы, интактная акросома, индекс фрагментации ДНК) использовали сперму баранов-производителей, замороженную в полипропиленовых соломинках.

Подвижность спермиев изучали визуально в световом микроскопе, увеличение х 180 раз, все образцы при микроскопии помещали на термостолик, который был подогрет до t +38 °С. Этот же образец подвергали исследованию на спер-моанализаторе Andro Vision Minitube, позволяющем фиксировать концентрацию, подвижность и скорость движения половых клеток. С помощью микроскопа рассчитывали количественное соотношение прямолинейно-поступательного движения к общему числу спермокле-ток. В исследуемых образцах мы подробно изучили параметры скорости движения спермато- зоидов благодаря расширенной спермаграмме и диаграмме:

• 1.    VCL – криволинейная скорость (мик-рон/секунд). Скорость движения спермиев по фактическому пути.

• 2.    VSL – прямолинейная скорость (мик-рон/секунд). Скорость перемещения спермиев в прямолинейном направлении.

• 3.    VAP – средняя скорость по траектории (микрон/секунд). Скорость в расчете на среднюю длину пути.

• 4.    LIN – линейность . Индекс линейности движения реального пути.

• 5.    STR – прямолинейность . Индекс прямолинейности движения средней траектории пути.

• 6.    BCF – частота колебаний (бие-ний/секунд). Средняя частота, с которой реальная траектория спермоклетки пересекает усредненную траекторию.

• 7.    ALH – амплитуда бокового смещения головки . Отклонение головки относительно средней траектории.

• 8.    WOB – колебание . Величина, описывающая колебание реальной траектории относительно усредненной, VAP/VCL.

В зависимости от направления движения все половые клетки, по рекомендациям ВОЗ, делят на 3 категории.

• 1.    Прогрессивно-подвижные сперматозоиды (PR) (когда клетки осуществляют движение по прямой).

• 2.    Непрогрессивно-подвижные сперматозоиды (NP) (когда клетки двигаются по кругу и имеют малый радиус перемещения).

• 3.    Неподвижные сперматозоиды (IM).

Интактную акросому и аномальные формы спермиев выявляли с помощью тест-набора «Дифф-Квик». Экспресс-метод основан на минимально затраченном времени. Приготовленные мазки из разбавленной спермы фиксировали буферным раствором. После остатки раствора сливали на фильтровальную бумагу и переходили к красителю № 1 (розовый), используя дозатор на 1–2 мл и равномерно покрывая каждое предметное стекло биожидкостью. Для прокраски требуется 10 мин, далее остатки красителя сливаем на фильтровальную бумагу. На прокрашенную основу наносим краситель № 2 (синий), полностью покрывая розовую зону, даем прокраситься 10 мин и смываем, окуная в емкость с дистиллированной водой два-три раза. Спермии считали морфологически нормальными, если все структурные элементы его сохранены и соответствовали известным нормам. Расчет производили высчитывая от процента общего числа нормальных спермиев число поврежденных по различным критериям и категориям повреждений, таких как аномальные головки, склоненная головка, скрученные и сломанные хвосты, оторвавшиеся головки.

Состояние дизоксирибонуклеиновой кислоты в ядре и митохондриях изучали методом акри-дин-оранжевого теста. Микроскопирование проводили с использованием флуоресцентного микроскопа. Этот метод считают одним из современных в системе биологической экспертизы племенной продукции, так как он является одним из технологически усовершенствованных маркеров апотоза (играет особую роль в регуляции фертильности), что необходимо учитывать при искусственном и естественном осеменении сельскохозяйственных животных. В каждом препарате насчитывают от 100 до 200 сперматозоидов, сначала подсчитывали сперматозоиды с неповрежденной, далее с фрагментированной ДНК. Сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в оттенки красного цвета, а целые в зеленый. Подсчет ведется по формуле, указанной в МУ «Определение индекса фрагментации ДНК в замороженной сперме у животных-производителей».

Результаты исследования и их обсуждение. При оценке качества семени мы провели исследования полученного эякулята во всех образцах. Сперма, сохраняемая более 25–30 мин после взятия, по физическим показателям соответствовала требованиям и нормам ГОСТ 322002013. Сперма баранов-производителей однородная, молочно-белая с желтым оттенком, вязкая, без примеси крови, гноя и мочи.

Оценку спермы по густоте проводили на микроскопе при увеличении в 180 раз. Степень насыщения спермы спермиями – густая (Г).

Рис.1. Оценка спермы по густоте. Область с незначительными промежутками (Ув. х 180)

При определении подвижности сперматозоидов в результате проведенных нами исследований все полученные показатели были включены в следующие категории:

^ PR (прогрессивно-подвижные (нормоки-незис) – быстрая прямолинейно-поступательная подвижность, медленная прямолинейнопоступательная подвижность);

^ NP (непрогрессивно-подвижные (гипоки-незис) – круговая подвижность, локальная подвижность);

^ IM (неподвижные (акинезис) - мертвые).

Таблица 1

Показатели подвижности свежеполученной и криоконсервированной спермы, %

Общее кол-во проанализ, спермы		1 802,00
Количество полей		2.00
Концентрация	[107мл]	352,31
Общая подвижность	(%)	98,06
Поступательная подвижность	с%>	92,73
■ Быстрая поступ. подв-ть	W	63,65
Медл. поступ. подв-ть	W	27,86
■ Круговая подвижность	(%)	1,22
Локальная подвижность	(%)	5,33
■ неподвижный	(%)	1,94
Общ. кол-во сперм/доза	[13Т	528,46

Критерий	Свежеполученная сперма	Криоконсервированная сперма
PR	92,4 – соотв. норме	13,2 – не соотв. норме
PR+NP	97,1 – соотв норме	58,89 – соотв. норме

	VCL (pm,'сек)	VSL (ртАсек)	VAP (рт/сек)	DCL [рт]	DSL ftim]	DAP (pm]	ALH [pm]	BCF (Hz)	НАС (рад)	WOB (VAP/VCL)	LIN (VSL/VCL	STR (VSL/VAP)
Сред.зн.переж,	172,71	68,99	89,24	37,02	13,12	18,08	1,76	12,03	0,43	0,52	0,40	0,77

Рис. 2. Анализ свежеполученного эякулята

	VCL (рт/сек)	VSL (рт/сек)	VAP (р т/сек)	DCL [Щп]	DSL [Мт]	DAP &ип]	ALH [рт]	BCF (Hz)	НАС (рад)	WOB LIN (VAP/VCL) (VSUVCL	STR (VSUVAP)
Сред.зн.переж,	55,30	36,75	39.93	7,39	2,76	3,56	0,40	0,90	0,17	0,72     0,66	0,92

Рис. 3. Анализ криоконсервированной спермы

Общее кол-во проанализ. спермы		6 528.00
Количество полей		3,00
Концентрация	[107мл]	425,43
Общая подвижность	W	54,78
Поступательная подвижность	W	15,46
■ Быстрая лоступ. подв-ть	W	10,22
Медл. лоступ. подв-ть	(%)	5,13
■ Круговая подвижность	(%)	0,11
Локальная подвижность	(%)	39,32
■ неподвижный	(%)	45,22
Общ. кол-во слерм/доза	[«п	425,43

По показателям подвижности были проведены исследования 20 спермопроб от 10 баранов-производителей. Показатель ППД в криоконсер-вированной сперме варьировал от 10,27 до 15,46 %, что не соответствует нормам ГОСТ 32200-2013 (не менее 40 %), показатель ло- кальной подвижности варьировал от 39,32 до 55,00 %. Показатель ППД в свежеполученной сперме варьировал от 88,12 до 96,23 %, что соответствует нормам ГОСТ 32200-2013 (не менее 80 %), показатель локальной подвижности варьировал от 1,89 до 6,9 %.

Таблица 2

Морфологические показатели свежеполученной и криоконсервированной спермы, %

Показатель	Свежеполученная сперма	Криоконсервированная сперма
Поврежденная акросома	5,9 (норма не более 10 %)	11,21 (норма не более 40 %) – соотв. норме
Аномальные формы	6,5 (норма не более 18 %)	16,36 (норма не более 20 %) – соотв норме

Были выявлены 5 спермопроб в свежеполу-ченном эякуляте с поврежденной акросомой более 10 %, которые не соответствовали нормам ГОСТ 32200-2013, – от 3 до 10 %. Средние показатели всех спермпороб: оторвавшиеся головки – 3,4 %; аномальные головки – 4,25; согнутые хвосты – 4,66; закрученные – 4,1 %. Были выявлены 7 спермопроб в замороженном эякуляте с аномальной морфологией более 20 %, которые не соответствовали нормам ГОСТ 32200-2013, – не более 20 %. Показатель интакной акросомы соответствовал нормам и составлял от 3,3 до 25 %, при норме не более 40 %.

Таким образом, морфологические нарушения спермиев выражают изменения в двигательной активности спермоклеток, снижают фертильную способность и их функциональную полноценность в процессе оплодотворения.

Состояние ДНК в сперматозоидах изучали методом SCSA. Измеряли процент сперматозоидов с высокой чувствительностью к pH-индуци-рованной денатурации, который обозначается как индекс фрагментации ДНК – DFI (этот параметр отражает уровень разрывов в ДНК).

Показатель индекса фрагментации ДНК (DFI) свежеполученной и криоконсервированной спермы, %

Таблица 3

Показатель	Свежеполученная сперма	Криоконсервированная сперма
DFI	7	29

Средний показатель количества сперматозоидов с фрагментацией ДНК составил в свеже-полученном эякуляте DFI < 7 %, в замороженооттаянном DFI 29 %. Оба показателя находятся в пределах нормы (не более 30 % с фрагменти- рованной ДНК). В нескольких свежеполученных и криоконсервированных спермопробах нами была выявлена фрагментация ядерной и митохондриальной ДНК более 30 % – DFIi 30 %.

Рис. 4. Большое количество спермиев, окрашенных в оранжевый цвет, свечение в хвостовой части, т.е. митохондриальная дисфункция. Ув. × 40

Рис. 5. Фрагментированная ядерная ДНК и митохондриальная ДНК сперматозоида. Ув. × 100

Рис. 6. Большое количество сперматозоидов с аномальной морфологией, несколько головок с незрелым ядром, имеющим аномальную структуру хроматина (HDS).

Заключение. Интерпретируя полученные результаты, можно сделать выводы по сравнительной оценке свежеполученной и криоконсер-вированной спермы. Установлено, что по показателю подвижности сперматозоидов имело место отклонение от нормы только в криокон-сервированной сперме, ППД = 13,204±0,1 %. При оценке морфологических показателей наибольшее количество поврежденных сперматозоидов было обнаружено в 7 криоконсервиро-ванных спермопробах с общей аномалий спер-миев, их среднее значение составляло 25,3 %, что не соответствует нормам ГОСТа. Также было выявлено в криоконсервированной сперме: оторвавшиеся головки – 15,85 %; дефектные головки – 10,2; согнутые хвосты – 6,97; закрученные – 5,55 %. Интактная акросома в крио-консервирванной сперме во всех спермопробах в пределах нормативных данных – ГОСТ не менее 90 %, но в свежеполученном эякуляте было выявлено в 5 спермопробах более 10 % сперматозоидов с поврежденной акросомой более 40 % – ГОСТ не менее 60 %. По показателю индекса фрагментации ДНК выявлено в свежепо-лученной сперме – 3 спермопробы и в криокон-сервированной – 9 спермопроб с фрагментированной ядерной и митохондриальной ДНК сперматозоидов – более 30 % – DFIi 30 % [6]. Определение морфофункциональных параметров спермы баранов-производителей позволяет наиболее полно и расширенно интерпретировать полученные данные спермограммы сельскохозяйственных производителей, установить связь морфофункциональных характеристик и репродуктивных параметров, а также установить критерии, влияющие на оплодотворяющую способность спермы в целом.

Новые методики исследования морфологических показателей позволяют более детально и точно определить биологическую полноценность спермопродукции. Полученные результаты исследований в дальнейшем могут быть стандартизированы, а показатель – индекс фрагментации ДНК включен в ГОСТ 32200-2013 (Средства воспроизводства. Сперма баранов. Технические условия).