Сравнительный анализ применения замороженных и нативных тестикулярных сперматозоидов после активации пентоксифиллином при азооспермии

Введение: Азооспермия – состояние, при котором в эякуляте отсутствуют сперматозоиды. Различают обструктивную азооспермию, при которой сперматозоиды не попадают в эякулят по причине непроходимости семявыносящих путей и не обструктивную азооспермию, при которой в яичках не формируются сперматозоиды. Возможно также их сочетание. В среднем по данным разных авторов, частота азооспермии составляет 10-15%у бесплодных мужчин и 1% у мужчин в общей популяции [1-3]. Хирургические методы получения сперматозоидов с последующим микроскопическим их обнаружением в биоптате в сочетании с методом оплодотворения с помощью интрацито-плазматического введения сперматозоида в яйцеклетку (далее - ИКСИ) являются единственным шансом для таких мужчин реализовать свой репродуктивный потенциал [4-8]. В 1995 г. были опубликованы данные об успешной тестикулярной биопсии с последующим проведением ИКСИ, результатом чего было наступление беременности [9]. В случаях проведения тестикулярной биопсии, как правило, обнаруживаются сперматозоиды с измененной морфологией, неподвижные сперматозоиды или сперматозоиды с единичными колебательными движениями. Дифференцировка живых форм от неживых представляется наиболее трудно решаемой задачей [10]. В соответствии с рекомендациями ВОЗ используются тесты для определения жизнеспособности сперматозоидов, например, окрашивание эозином. Однако, витальное окрашивание не позволяет их использовать для проведения оплодотворения [11].

Одним из эффективных способов оценки жизнеспособности сперматозоидов, полученных после биопсии, является активация их пентоксифиллином [12-15]. Хвост сперматозоида представляет собой комплекс микротрубочек, которые связаны между собой белковыми макромолеку- лами - денеинами. Когда денеины подвергаются дефосфорилированию, они становятся активными и заставляют скользить микротрубочки друг об друга, что приводит к движению. Этот процесс осуществляется с помощью циклического аденозинмонофосфата и протеинкиназы А. Пентоксифиллин – метилксантин, является ингибитором фосфодиэстеразы и способствует накоплению циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), который важен для приобретения сперматозоидами подвижности [16].

Цель исследования: оценить результаты применения активированных пентоксифиллином сперматозоидов, полученных после тестикулярной биопсии и сравнить показатели эмбриологического и клинического этапов при применении нативных и замороженных сперматозоидов для оплодотворения в программах вспомогательных репродуктивных технологий.

Материалы и методы исследования. В работе проведен ретроспективный анализ циклов вспомогательных репродуктивных технологий (далее - ВРТ) за 2019 год и 9 месяцев 2020 года на базе Республиканского Центра охраны здоровья семьи и репродукции (Махачкала, республика Дагестан) и ЗАО «Медицинская компания ИДК» (Самара). Разрешение на проведение клинического исследования одобрено Комитетом по биоэтике при Самарском государственном медицинском университете от 11 ноября 2020 года (протокол № 212). Из 1104 пациентов с установленным диагнозом бесплодия у 132 выявлена азооспермия, что составило 11,9%. Процедура тестикулярной биопсии была проведена 92 пациентам. Тестикулярные сперматозоиды получали из яичек в ходе открытой хирургической операции. Полученные пробы переносили в чашку Петри, содержащую буфер Sperm Preparation Medium (Origio). После чего тщательно измельчали препаровальными иглами ткань яичка для разрушения семенных канальцев и высвобождения из них сперматозоидов. Затем образцы просматривали под инвертированным микроскопом OLYMPUS IX71 при увеличении х600 на наличие сперматозоидов. В случаях диагностической биопсии (при необструктивной азооспермии и наличии риска востребованности донорского клеточного материала) при обнаружении сперматозоидов материал замораживали с использованием криопротектора SpermFreeze (Ferti-Pro) по стандартной методике, предложенной производителем. При проведении тестикулярной биопсии в день пункции и обнаружении сперматозоидов биоптат однократно откручивали с использованием буфера Sperm Preparatio Medium в центрифуге Scan Fuge Maxi (Cooper Surgical Fertility) при ускорении 1800g. После удаления надосадочной жидкости для стимуляции подвижности сперматозоидов к образцам добавляли пентоксифиллин в конечной концентрации 3,5 ммоль/л. Далее суспензию тестикулярных сперматозоидов инкубировали в термостате в течение 15 минут. Для проведения процедуры оплодотворения методом ИКСИ предварительно готовили чашки Петри. В центр чашки, в два ряда помещали по 5 капель среды Flushing Medium (Cooper Surgical Fertility) объемом 5 мкл для микроманипуляций, рядом наносили каплю среды PVP Clinical Grade (Cooper Surgical Fertility) объемом 5 мкл, для замедления движения сперматозоидов при проведении ИКСИ и покрывали тонким слоем парафинового масла Liquid Paraffin (Cooper Surgical Fertility). Далее чашки помещали в инкубатор на 15-20 минут для восстановления температуры и pH. Первый ряд капель для микроманипуляций оставляли для ооцитов, во второй ряд с помощью капилляра добавляли каплю со сперматозоидами, взятую из тестикулярной суспензии. Далее чашки убирали в инкубатор с 6% СО² и температурой 37°С на 15 минут. За это время тестикулярные сперматозоиды, приобретшие способность к движению после обработки пентоксифиллином, начинали активно двигаться к краю капли, что заметно облегчало их поиск и отбор, а затем сперматозоиды пере- носились в каплю PVP для иммобилизации перед проведением ИКСИ.

Оплодотворение проводили методом ИКСИ по стандартной технологии при увеличении х600. Оценку оплодотворения проводили через 16-18 часов после проведения ИКСИ. Нормальное оплодотворение расценивалось при наличии 2 PN и 2 PB (формирование зигот) [17]. Культивирование эмбрионов осуществляли в средах Continuous Single Culture Complete (CSCM-C) (Irvine Scientific) в инкубаторе Sanyo (6% СО²) до 5-6 суток эмбрионального развития. Оценку развивающихся эмбрионов на 5-6 сутки проводили в соответствии с классификацией Gardner (1999) [18].

Всего, в рамках данного исследования было проведено 91 процедуры тестикулярной биопсии, из которых 20 процедур были свежей биопсией, т.е. непосредственно в день пункции оплодотворение проводилось нативными сперматозоидами (I группа). В остальных 71 случаях биопсия была диагностической, т.е. проводилась заранее, из которых в 29 случаях сперматозоиды были найдены, криоконсервирова-ны и в 22 случаях разморожены для проведения процедуры оплодотворения (II группа). Был проведен анализ эмбриологических показателей циклов ВРТ в которых использовались нативные и замороженные тестикулярные сперматозоиды после активации пентоксифилином. Основные показатели формирования и развития эмбрионов: процент оплодотворения, процент дробления, процент развития до бластоцисты были рассчитаны в соответствии с The Vienna Consensus: Report of an Expert Meeting on the Development of ART Laboratory Performance Indicators (2017): % оплодотворения как отношение количества ооцитов с 2PN и 2РВ/общее количество инъецированных ооцитов МII х 100%; % дробления как отношение количества дробящихся эмбрионов 2 дня к общему количеству ооцитов с 2PN и 2PB x 100%; % дорастания до бластоцист как отношение количества бла-стоцист/общее количество ооцитов с 2PN и 2PB х 100%. Клинический показатель -частота наступления беременности (далее - ЧНБ) как отношение количества соно- графически подтвержденных беременно-стей/общее количество переносов х 100% [19].

Статистическую обработку результатов выполняли на компьютере в среде статистических вычислении ̆ R (Rv.4.0.3, RStudio v.1.3.1093), первичныи ̆ ввод данных производили с помощью электронных таблиц MS Excel. Использовали методы описательной статистики (проверка данных на соответствие нормальному распределению, расчет средних значений, стандартных ошибок, доверительных интервалов), ранговые методы Mann-Whitney-Wilcoxon и Кruskal-Wallis (для двух групп) для проверки гипотезы об отсутствии различий при использовании нативного и замороженного материала.

Результаты исследования и обсуждение. Оценка жизнеспособности сперматозоидов и их отбор для проведения оплодотворения медом ИКСИ являются одними из наиболее важных этапов в работе лаборатории ВРТ у пациентов с тяжелой формой мужского бесплодия, в том числе и при азооспермии. Активация единичных сперматозоидов с помощью пентоксифиллина после проведения тестикулярной биопсии позволяет отобрать подвижные сперматозоиды для проведения оплодотворения методом ИКСИ.

В ходе анализа было проведено сравнение основных эмбриологических и клинических показателей (таблица 1).

Таблица 1

Сравнительные эмбриологические и клинические показатели при использова- нии нативных и криоконсервированных тестикулярных сперматозоидов после активации пентоксифиллином M (95% ДИ)

В соответствии с полученными данными, процент оплодотворения оказался выше в группе с использованием нативных тестикулярных сперматозоидов, но статистически значимой разницы показателей оплодотворения в изучаемых группах выявить не удалось. Это дает основание предполагать о снижении оплодотворяющей способности тестикулярных сперматозоидов после замораживания и возможном негативном влиянии криоконсервации на сперматозоиды. Известно, что в среднем после замораживания подвижность сперматозоидов снижается на 1520% [20]. Тестикулярные сперматозоиды, имеющие, как правило, более низкие показатели морфологии и подвижности, возможно оказываются более уязвимыми к воздействию низких температур. Показатели преимплантационного развития эмбрионов (процент дробления и процент дорастания до бластоцист) оказались примерно одинаковыми в группах сравнения, и также статически значимой разницы обнаружить не удалось (таблица 1).

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что предварительно криоконсервированные сперматозоиды могут быть использованы с последующим размораживанием для оплодотворения в практике эмбриологических лабораторий в определенных клинических ситуациях (например, при азооспермии). Применение пентоксифиллина позволяет идентифицировать жизнеспособные гаметы и отбирать их для проведения ИКСИ, добиваться сопоставимых результатов по пре-имплантационному развитию эмбрионов.

Основной клинический показатель - ЧНБ оказался сопоставимым и не показал достоверной разницы в исследуемых группах (таблица 1). Это может свидетельствовать о формировании компетентных эмбрионов при применении заморожен- ного и нативного биологического материала. То есть предположение о снижении оплодотворяющей способности тестикулярных сперматозоидов после криоконсервации в рамках данного исследования не получило статистически значимого подтверждения.

Проведя более детальный анализ показателей исследуемых групп, мы обнаружили, что все беременности в прошедших циклах ВРТ с использованием как нативных, так и криоконсервированных тестикулярных сперматозоидов были получены в подгруппе женщин младше 35 лет. Беременностей в группе старше 35 лет не получено. Скорее всего, это связано с определяющей ролью ооцита в раннем развитии эмбриона и повышением уровня анеуплоидий у женщин старше 35 лет, что является основной причиной неудач при лечении бесплодия методами ЭКО.

Заключение. Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать следующие выводы. Ингибитор фосфодиэстеразы - пентоксифиллин может быть использован для активации и отбора жизнеспособных сперматозоидов для оплодотворения в свежем биоптате и после криоконсервации. Процент оплодотворения при использовании криоконсервирован-ных сперматозоидов несколько ниже по сравнению с этим же показателем в группе применения нативных гамет, но статически значимой разницы в рамках данного исследования обнаружить не удалось. Показатели преимплантационного развития эмбрионов сопоставимы в исследуемых группах. Показатель частоты наступления беременности, вне зависимости от того, какие тестикулярные сперматозоиды используются (нативные или после предварительной криоконсервации), выше у женщин, которые моложе 35 лет, что подтверждает определяющую роль ооцитов в раннем преимплантационном развитии эмбрионов человека. Полученные результаты не могут считаться окончательными и требуют накопления дополнительных данных и их более тщательного анализа.