Сравнительный анализ противоопухолевой эффективности фотодинамической терапии с фотосенсибилизаторами амидоаминхлорин и липосомальный амидоаминхлорин на экспериментальной модели опухоли (саркома М-1) крыс

Фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой перспективный метод в онкорадиобиологии и клинической радиоонкологии [1-6]. В основе ФДТ лежит цитотоксическое действие синглетного кислорода и других высокоактивных биологических окислителей, которые образуются в ходе фотохимических реакций [7, 8]. В онкологии ключевую роль играют компоненты ФДТ: фотосенсибилизатор (ФС), локальное облучение опухоли светом определённой длины волны, соответствующей пику поглощения ФС, а также плотность энергии и мощности лазерного излучения [9, 10]. Важным моментом дальнейшего развития метода ФДТ является снижение её побочных эффектов, создание рациональных лекарственных форм, обеспечивающих достаточный терапевтический эффект при минимальном повреждении окружающих здоровых тканей [11-16]. Одним из путей решения этой задачи является создание системы направленного транспорта ФС в виде липосомальной формы [17]. В настоящее время в ФДТ злокачественных новообразований большой интерес вызывают производные ряда хлорофилла, а также ведутся активные работы по созданию липосомальных форм таких ФС. Они проявляют на порядок большую световую токсичность, чем большинство ФС, при отсутствии темновой токсичности,

Малыгина А.И. – ст. научн. сотр., к.б.н.; Михайловская А.А.* – зав. лаб., к.б.н.; Дрожжина В.В. – научн. сотр.; Архипова Л.М. – мл. научн. сотр.; Осипчук Ю.С. – научн. сотр. МРНЦ им. А.Ф. Цыба – филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России. Пономарев Г.В. – гл. научн. сотр., д.х.н., проф. ИБМХ;

Цель исследования: сравнение противоопухолевой эффективности ФДТ с амидоамин-хлорином и липосомальным амидоаминхлорином в отношении саркомы М-1 крыс для определения наиболее эффективного ФС.

СООСН3

С 38 H 46 N 6 O 5

MW 666.82

Рис. 1. Формула ФС амидоаминхлорина.

Материалы и методы

Исследования проведены на 113 самках беспородных крыс. В качестве экспериментальной модели опухоли использовали саркому М-1 крыс, которую перевивали под кожу в область бедра в виде кусочков опухоли донора. В опыт крыс брали на 7-9 день, когда опухоль достигала в диаметре 0,7-1,0 см, шерстный покров в области облучения депилировали. В качестве ФС использовали амидоаминхлорин и липосомальный амидоаминхлорин, являющиеся химической модификацией хлорина е6. Сравнение противоопухолевой эффективности вели на группах животных, которым проводили ФДТ с одинаковыми дозами ФС и одинаковыми параметрами лазерного излучения (плотность энергии (Е) и плотность мощности (Ps)) [18-20].

В опыте с амидоаминхлорином было 4 группы животных:

1-я группа:	доза ФС – 1,25 мг/кг,	E=150 Дж/см2,	Ps=0,34 Вт/см2
2-я группа:	доза ФС – 1,25 мг/кг,	E=150 Дж/см2,	Ps=0,51 Вт/см2
3-я группа:	доза ФС – 2,5 мг/кг,	E=150 Дж/см2,	Ps=0,51 Вт/см2
4-я группа:	доза ФС – 2,5 мг/кг,	E=300 Дж/см2,	Ps=0,51 Вт/см2

Контроль:     крысы-опухоленосители без какого-либо воздействия.

В опыте с липосомальным амидоаминхлорином было также 4 группы животных:

1-я группа:	доза ФС – 1,25 мг/кг,	E=150 Дж/см2,	Ps=0,34 Вт/см2
2-я группа:	доза ФС – 1,25 мг/кг,	E=150 Дж/см2,	Ps=0,51 Вт/см2
3-я группа:	доза ФС – 2,5 мг/кг,	E=150 Дж/см2,	Ps=0,51 Вт/см2
4-ягруппа:	доза ФС – 2,5 мг/кг,	E=300 Дж/см2,	Ps=0,51 Вт/см2

Контроль:     крысы-опухоленосители без какого-либо воздействия.

Через 3,5 часа после внутрибрюшинного введения ФС опухоль облучали лазером. Этот интервал определён ранее проведёнными исследованиями кинетики накопления ФС в опухоли и здоровой ткани крыс с помощью спектрофлуоресцентного метода на комплексе ЛЭСА-01 – «Биоспек», Россия.

Животные при лазерном облучении находились под общим тиопенталовым наркозом (внутрибрюшинно 2,5% раствор в объёме 0,2 мл/100 г массы животного).

Источником лазерного излучения служил полупроводниковый лазерный аппарат «Аткус-2» производства ЗАО «Полупроводниковые приборы» (Санкт-Петербург) с длиной волны излучения 662±1 нм. Диаметр светового пятна составлял 1,5 см. Объём опухоли измеряли: до проведения ФДТ (V 0 ), на 3, 7, 10, 14 и 21 сутки (V t ) после ФДТ.

Противоопухолевую активность ФС оценивали (по рекомендации Фармкомитета по исследованию новых фармакологических препаратов):

• 1.    По коэффициенту абсолютного прироста опухоли (К).

• 2.    По торможению роста опухоли (ТРО%).

• 3.    По проценту животных в группе с полной регрессией (ПР) опухоли (К=-1,00).

Статистический анализ результатов исследований проводили в компьютерной программе «Statistica 6» следующими методами: описательная статистика, непараметрический метод для сравнения 2-х независимых групп – U-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney U-test), непараметрический однофакторный дисперсионный анализ для сравнения 3-х и более независимых групп – критерий Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis one-way analysis of variance).

Результаты и обсуждение

Изучение противоопухолевой эффективности по срокам исследования после ФДТ в сравнении с контролем

Амидоаминхлорин. После ФДТ во всех группах и по всем срокам исследования наблюдался противоопухолевой эффект, который выражался в торможении роста и полной регрессии опухоли (табл. 1). По мере увеличения дозы ФС, плотности энергии и плотности мощности лазерного излучения процент ТРО и опухоли возрастал. В группе 4 при дозе ФС 2,5 мг/кг, E=300 Дж/см² и плотности мощности Ps=0,51 Вт/см² до конца исследования (до 21 суток после ФДТ) наблюдалась полная регрессия опухоли у 100% животных. При данных параметрах проведения ФДТ отмечали максимальную противоопухолевую эффективность. Также эффективными для противоопухолевой терапии были группы 2 и 3 с дозами амидоаминхлорина – 1,25 и 2,5 мг/кг, E=150 Дж/см² и Ps=0,51 Вт/см². В группе 1 по всем срокам исследования при параметрах проведения ФДТ 1,25 мг/кг, 150 Дж/см² и 0,34 Вт/см², ТРО составил 65,9% и ПР – 50%.

Липосомальный амидоаминхлорин. После ФДТ с липосомальным амидоаминхлорином , проведённой с теми же дозами ФС и параметрами лазерного излучения как с амидоаминхлори-ном , мы также получили противоопухолевый эффект во всех исследуемых группах животных (табл. 1). Но ПР опухоли у 100% животных мы наблюдали уже при дозе ФС 1,25 мг/кг, E=150 Дж/см² и Ps=0,51 Вт/см² лазерного излучения (в группе 2).

И даже при самых минимальных параметрах проведения ФДТ (1,25 мг/кг, 150 Дж/см2 и 0,34 Вт/см2) в группе 1 на 21 сутки наблюдался рост опухоли и только у одного животного (ТРО – 99,9% и ПР – 88,9%).

Таблица 1

Динамика роста саркомы М-1 крыс после ФДТ при внутрибрюшинном введении амидоаминхлорина и липосомального амидоаминхлорина в разных дозах и при различных параметрах лазерного излучения в сравнении с контролем

№ гр.	Схема проведения ФДТ	1.    Объём опухоли (V) 2.    Торможение роста опухоли (ТРО%) 3.    Полная регрессия опухоли (ПР%)
		Сроки наблюдений
		3 сутки     1	7 сутки     1	10 сутки     1	14 сутки     1	21 сутки
ФС –	амидоаминхлорин
1	1,25 мг/кг 150 Дж/см2 0,34 Вт/см2	0,023±0,016 96,3 77,8	0,125±0,076 94,5 66,7	0,284±0,187 92,6 66,7	1,082±0,685 85,5 50,0	4,695±2,330 65,9 50,0
2	1,25 мг/кг 150 Дж/см2 0,51 Вт/см2	Полная регрессия опухоли у 100% животных	0,046±0,035 98,0 62,5	0,088±0,051 97,7 62,5	0,332±0,182 95,6 50,0	1,035±0,453 92,5 50,0
3	2,5 мг/кг 150 Дж/см2 0,51 Вт/см2	Полная регрессия опухоли у 100% животных		0,006±0,006 99,8 87,5	0,083±0,039 99,6 50,0	0,288±0,144 97,9 50,0
4	2,5 мг/кг 300 Дж/см2 0,51 Вт/см2	Полная регрессия опухоли у 100% животных
Контроль (V)		0,627±0,055  1	2,287±0,204  1	3,858±0,433  1	7,461±1,014  1	13,787±1,543
ФС –	липосомальный амидоаминхлорин
1	1,25 мг/кг 150 Дж/см2 0,34 Вт/см2	Полная регрессия опухоли у 100% животных				0,010±0,010 99,9 88,9
2	1,25 мг/кг 150 Дж/см2 0,51 Вт/см2	Полная регрессия опухоли у 100% животных
3	2,5 мг/кг 150 Дж/см2 0,51 Вт/см2	Полная регрессия опухоли у 100% животных
4	2,5 мг/кг 300 Дж/см2 0,51 Вт/см2	Полная регрессия опухоли у 100% животных
Контроль (V)		0,609±0,064  1	2,324±0,254 1	4,030±0,534  1	7,495±1,196  1	14,051±1,604

Таким образом, ФДТ с амидоаминхлорином и липосомальным амидоаминхлорином является эффективной противоопухолевой терапией. При всех изученных параметрах проведения ФДТ и на всех сроках исследования мы наблюдали ингибирующий эффект. Полная регрессия опухоли у 100% животных наблюдалась (до 21 суток исследования) при параметрах проведения ФДТ – с амидоаминхлорином в дозе 2,5 мг/кг, E=300 Дж/см² и Ps=0,51 Вт/см² лазерного воздействия, с липосомальным амидоаминхлорином такой же эффект отмечался уже при дозе ФС 1,25 мг/кг, E=150 Дж/см², Ps=0,51 Вт/см², то есть, в 2 раза меньшей дозе ФС и в 2 раза меньшей плотности энергии лазерного излучения. В контроле ни снижения темпа прироста, ни полной регрессии опухоли не отмечалось.

Статистический анализ противоопухолевой эффективности ФДТ с ФС в разных лекарственных формах

Чтобы доказать, что группы равны по противоопухолевой эффективности или различаются друг от друга и определить уровень различия, необходимо провести статистический анализ.

Для сравнения противоопухолевой эффективности ФДТ был взят коэффициент абсолютного прироста опухоли: данные по группам за весь период наблюдения – 21 сутки (табл. 2, рис. 1а, б). По этой таблице и графикам можно предварительно судить о значимости различия средних значений коэффициента абсолютного прироста опухоли при различных параметрах проведения ФДТ с ФС в разных лекарственных формах.

Таблица 2 Количество данных в группах, средняя величина коэффициента абсолютного прироста опухоли и стандартное отклонение от средней

а)

Амидоаминхлорин

контроль            1,25мг, 15ОДЖ,0,51Вт       2,5мг,300Дж,0,51Вт J Mean±1,96*SE

1,25мг, 150ДЖ 0,34Вт        2,5мг, 150ДЖ, 0,51 Вт

б)

Ь

Липосомальный амидоаминхлорин

-5

О

о Mean

□ MearttSE

1,25 мг, 150Д ж, 0,51 Вт контроль

1,25мг, 15ОД>К 0,34Вт

2 5к,150Дж, 0,51Вт

2,5мг,ЗООДжО,51Вт J Mean±1,96*SE

	Средняя (M)	Количество данных (n)	Стандартное отклонение (δ)
Амидоаминхлорин
Контроль	23,15338	77	22,76371
1,25 мг; 150 Дж; 0,34 Вт	5,03543	35	13,23114
1,25мг;150 Дж; 0,51 Вт	2,76150	40	9,23960
2,5 мг;150 Дж;0,51 Вт	0,19700	40	3,76391
2,5 мг; 300 Дж; 0,51 Вт	-1,00000	40	0,00000
Липосомальный амидоаминхлорин
Контроль	24,21476	63	24,92338
1,25 мг; 150 Дж; 0,34 Вт	-0,96933	45	0,20572
1,25 мг;150 Дж; 0,51 Вт	-1,00000	51	0,00000
2,5 мг; 150 Дж; 0,51 Вт	-1,00000	51	0,00000
2,5 мг; 300 Дж; 0,51 Вт	-1,00000	90	0,00000

Рис. 1 . На данных графиках показаны средние значения коэффициента абсолютного прироста опухоли, стандартная ошибка (±) и 95% доверительный интервал: амидоаминхлорин (а); липосомальный амидоаминхлорин (б).

Множественное сравнение групп проводили с помощью дисперсионного анализа, который проверяет нулевою статистическую гипотезу Н 0 об отсутствии различий групп. В дисперсионном анализе ранговый анализ вариаций по Краскелу-Уолллису проверяет нулевую статистическую гипотезу Н 0 об отсутствии различий групп по рангам. Медианный тест проверяет ту же нулевую гипотезу Н 0 путём анализа генерируемых таблиц сопряжённости с использованием критерия χ². В нашем исследовании при сравнении всех групп по средним рангам и по медианному тесту нулевая гипотеза отклоняется (p<0,001) и следует принять альтернативную гипотезу о существовании различий групп. И далее проводили попарное сравнение групп.

Множественное попарное сравнение проводили методом Манна-Уитни с поправкой Бон-феррони. Поправка Бонферрони хорошо работает, если число пар сравнений невелико. Если оно превышает 8, метод становится слишком «строгим», и даже весьма большие различия приходится признавать незначительными.

Поэтому сначала провели сравнение эффективности ФДТ внутри групп с ФС амидоамин-хлорином и затем сравнение внутри групп с липосомальным амидоаминхлорином.

При сравнении четырёх групп (6 пар сравнений) установленный уровень достоверности различия p≤0,05/6 = p≤0,008.

Статистический анализ показал, что противоопухолевая эффективность ФДТ с амидоа-минхлорином в группах 1, 2 достоверно отличается от группы 4, где у всех животных ПР опухоли (1-я группа – p=0,003; 2-я группа – p=0,004). Самая близкая группа по эффективности ФДТ с группой 4 – это группа 3 (p=0,083), и хотя различие недостоверно, но оно значительно отличается от группы 4.

Проведённый анализ с липосомальным амидоаминхлорином показал, что группы 2, 3 и 4 одинаковые. Эти группы с максимальной противоопухолевой эффективностью и они равны между собой (p=1,000). Эффективность ФДТ в группе 1, где ФДТ проводили с минимальными параметрами, незначительно отличается от остальных групп (p=0,860).

Затем выбрали наиболее эффективную группу и близкую к ней по эффективности с ами-доаминхлорином и с липосомальным амидоаминхлорином и сравнили их между собой. Для сравнения с липосомальным амидоаминхлорином взяли группу 2 и близкую к ней группу 1. Для амидоаминхлорина – это группы 3 и 4. Таким образом, у нас для сравнения четыре группы, т.е. установленный уровень достоверной значимости остаётся прежний (p=0,008).

При данном сравнении 2-х ФС мы получили, что группа 2 с липосомальным амидоамин-хлорином (1,25 мг/кг; 150 Дж/см²; 0,51 Вт/см²) равна по ингибирующему эффекту группе 4 с амидоаминхлорином (2,5 мг/кг, 300 Дж/см², 0,51 Вт/см²; p=1,000). Т.е. липосомальный амидоа-минхлорин при снижении в 2 раза дозы ФС и плотности энергии лазерного излучения вызывает равный противоопухолевый эффект с амидоаминхлорином.

А группа 1 с липосомальным амидоаминхлорином при минимальных параметрах проведения ФДТ (1,25 мг/кг; 150 Дж/см²; 0,34 Вт/см²) незначительно отличается по ингибирующему воздействию от групп с максимальной противоопухолевой эффективностью ФДТ (от группы 2 с липосомальным амидоаминхлорином и от группы 4 с амидоаминхлорином , где p=0,860).

Группа 3 с амидоаминхлорином (2,5 мг/кг; 150 Дж/см²; 0,51 Вт/см²) значительно, хотя и недостоверно, отличается по ингибирующему действию от групп с максимальной противоопухолевой эффективностью ФДТ (от группы 2 с липосомальным амидоаминхлорином и от группы 4 с амидоаминхлорином – p=0,083). И почти так же значительно отличается от группы 1 с липосомальным амидоаминхлорином (1,25 мг/кг; 150 Дж/см²; 0,34 Вт/см²; p=0,103).

Таким образом, противоопухолевая эффективность ФДТ с липосомальным амидоамин-хлорином достоверно выше, чем с амидоаминхлорином.

Выводы

• 1.    Установлено, что максимальная эффективность ФДТ с амидоаминхлорином в отношении саркомы М-1 наблюдается в дозе 2,5 мг/кг, при E=300 Дж/см² и Ps=0,51 Вт/см² лазерного излучения.

• 2.    Показано, что максимальная эффективность ФДТ с липосомальной формой амидоа-минхлорина в отношении саркомы М-1 наблюдается уже в дозе 1,25 мг/кг, при плотности энергии лазерного излучения 150 Дж/см² и Ps=0,51 Вт/см², т.е. липосомальный амидоаминхлорин при снижении в 2 раза дозы ФС и плотности энергии лазерного излучения вызывает равный противоопухолевый эффект с амидоаминхлорином .

• 3.    По всем проведённым исследованиям доказано явное преимущество липосомального амидоаминхлорина по противоопухолевой эффективности ФДТ в более малых дозах ФС и более щадящих параметрах лазерного облучения.