Сравнительный анализ влияния света, генерируемого различными источниками освещения, на функциональную активность нейтрофилов in vitro

Проблема воздействия света на факторы врождённого иммунитета человека и функцию нейтрофильных гранулоцитов, клеток играющих важнейшую роль в осуществлении клеточных реакций врожденного иммунитета, является актуальной, социально значимой и дискутабельной [1]. С одной стороны, ряд исследователей представляет доказательную базу того, что световые воздействия разных источников света так или иначе влияют на механизмы врождённого и адаптивного иммунитета, активируя, или наоборот приводя к иммунным дисфункциям, в частности снижая фагоцитарную активность эффекторов врождённого иммунитета и приводя к блокаде ответа фагоцитирующих клеток на дополнительную стимуляцию, снижая тем самым способность клеток к реализации резервных биоцидных возможностей [2, 4]. С другой стороны, О.А. Гизингер, М.В. Осиковым были высказаны предположения об отсутствии выраженных иммунотропных эффектов света, генерируемых светодиодными носителями [3, 5–7, 10]. В сложившейся ситуации регистрация структурных и функциональных изменений клетки при встрече с квантами света, генерируемыми различными источниками: лампами накаливания, люми-нисцентными лампами, светодиодами, является объективным параметром для выбора оптимальных источников для формирования комфортной для человека и безопасной с санитарно-гигиенической точки зрения концепции освещения закрытых помещений и открытых пространств [8, 11].

Имеющиеся на сегодняшний день сведения о возможных иммуномодулирующих эффектах светодиодных источников освещения, безусловно, требуют определённой систематизации и анализа

[3, 6, 7]. Спорные вопросы, касающиеся проблемы реактивности нейтрофилов под действием различных источников света, свидетельствуют о целесообразности проведения экспериментальных работ по изучению светового воздействия на эти клетки, что чрезвычайно перспективно в клиническом плане, поскольку полученные результаты позволят расширить наши представления об особенностях функционирования системы врождённого иммунитета у людей, находящихся под воздействием различных источников света, что в практическом плане позволит уточнить социально-гигиенические нормы применения светодиодных источников для интерьерного освещения зданий общественного назначения [5, 11].

Цель работы – исследовать влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов в экспериментальных условиях in vitro.

Материалы и методы. В соответствии с поставленной целью на базе НИИ иммунологии, научно-образовательного центра «Проблемы фундаментальной медицины» ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава РФ исследована функциональная активность нейтрофилов клинически здоровых лю-дей-добровольцев. Выбор донорских нейтрофилов в качестве клеток-мишеней был обусловлен, с одной стороны, их полифункциональной ролью в поддержании гомеостаза в организме, с другой – доступностью и, в определённом смысле, простотой исследования отдельных показателей их функциональной активности [11, 12]. Функции нейтрофильных гранулоцитов разнообразны: способность к поглощению патогенов, высвобождение широкого спектра микробоцидных компонен- тов, в том числе эндогенных антимикробных пептидов, синтез вазоактивных и хемотаксических медиаторов, играющих важную роль в развитии процесса воспаления, регуляции врожденного и адаптивного иммунитета [10]. Благодаря этим продуктам, нейтрофилы осуществляют разнообразные и разнонаправленные регуляторные бактерицидные внутри- и внеклеточные эффекты [2, 4]. При постановке данного эксперимента, авторы преследовали цель изучить возможные иммуно-тропные эффекты света, излучаемого светодиодами, лампами накаливания, люминесцентными лампами, естественным солнечным освещением при различных временных промежутках. Время воздействия излучения в диапазоне длин волн 320–400 нм при 0,03 Вт/м2 излучения составило 10, 20 и 30 мин при температуре 37 °С.

Для выделения нейтрофилов кровь забирали из локтевой вены 60 здоровых студентов дневной формы обучения ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава РФ в возрасте от 18 до 22 лет. Добровольцы, участвовавшие в исследовании, дали письменное добровольное информированное согласие в соответствии с требованиями Хельсинской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983, 1989, 2000, 2002 г.; основами законодательства Российской Федерации «Об охране здоровья граждан, правил проведения клинической практики в РФ» (приказ МЗ РФ № 266 от 19.07.03 г.; приказ Росздравнадзора № 2325-Пр/06 от 17.10.06 г.). Протокол исследования и текст информированного согласия одобрены этическим комитетом ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава РФ.

Цельную кровь в объеме 10 мл (антикоагулянт гепарин («Гедеон-Рихтер», Венгрия), 50 ЕД/мл) получали пункцией локтевой вены, для выделения чистой фракции нейтрофилов 2 мл крови смешивали с 3 мл стерильного физиологического раствора (0,9%-ный раствор натрия хлористого), полученную смесь наслаивали на градиент плотности стерильных растворов фиколла («Pharmacia», Швеция) и верографина («Spofa», Чехия), плотность верхнего слоя 1,075–1,077 г/см3, нижнего – 1,093–1,095 г/см3 и центрифугировали 40 мин при 1500 об/мин. Кольцо нейтрофилов собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, отмывали от градиента стерильным раствором Хенкса путём центрифугирования при 1500 об/мин дважды по 7 мин, после чего доводили до концентрации 5 · 106 клеток/мл и использовали для оценки функционального статуса нейтрофилов. Жизнеспособность нейтрофилов, рассчитанная в тесте с 0,1%-ным раствором трипанового синего, составила 98 %.

60 проб нейтрофилов были случайным образом разделены на 4 группы по 15 проб, на которые в течение 10, 20 и 30 мин при температуре 37 °C воздействовали различными источниками света:

группа 1 (контрольная) – естественное освещение; группа 2 – свет, генерируемый лампами накаливания; группа 3 – свет, генерируемый люминесцентными лампами; группа 4 – свет, генерируемый светодиодными источниками.

Опытные и контрольные пробы, содержащие суспензию нейтрофилов, во время облучения находились в специально оборудованных для проведения эксперимента термостатах. Световое поле конфигурировали таким образом, чтобы в любой точке суспензии нейтрофилов отклонение плотности светового потока составляло не более 10 % от заданного. Фагоцитарную и лизосомальную активность нейтрофилов исследовали по методике И.С. Фрейдлин, кислородзависимый метаболизм и функциональный резерв оценивался в НСТ-тесте в модификации А.Н. Маянского и М.Е. Виксмана. Для определения функционального резерва клеток показатели исследовали в спонтанном и индуцированном режимах.

Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0 с вычислением средней арифметической и её стандартной ошибки. О достоверности различий средних величин судили с помощью непараметрического критерия Манна – Уитни. Различия считали значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты и обсуждение. При изучении функциональной активности нейтрофилов in vitro установлено, что нейтрофилы, выделенные из периферической крови клинически здоровых людей-добровольцев, фагоцитируют частицы латекса, обладают активным лизосомальным аппаратом и способны к кислородзависимому метаболизму (табл. 1).

Десятиминутное воздействие света, генерируемого как светодиодными источниками, так и лампами накаливания на взвесь нейтрофильных гранулоцитов не привело к достоверным изменениям их лизосомальной и фагоцитарной активности, кислород-зависимого метаболизма, функционального резерва (р > 0,05). НСТ-редуцирующая активность нейтрофилов в спонтанном режиме возрастала после воздействия света люминисцент-ных ламп по сравнению с естественным и светодиодным освещением (р = 0,05).

Анализ данных, полученных после изучения лизосомальной, фагоцитарной активности и биоцидных возможностей нейтрофилов в НСТ-тесте, функционального резерва нейтрофильных гранулоцитов после 20-минутного воздействия также не выявил различий в показателях лизосомальной и фагоцитарной активности, освещенных естественным светом, лампами накаливания и светодиодными источниками (р > 0,05). После воздействия света люминисцентных ламп увеличивалось количество активных клеток в спонтанном НСТ-тесте (р = 0,05) по сравнению с естественным освеще-

Проблемы здравоохранения

Таблица 1

Влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro (время экспозиции 10 мин)

Показатель	Группа 1 (естественное освещение)	Группа 2 (лампы накаливания)	Группа 3 (лампы люминесцентные)	Группа 4 (лампы светодиодные)
Люминесценция лизосом, у. е.	305,81 ± 14,1	302,91 ± 14,31	306,81 ± 13,92	304,91 ± 14,7
Активность лизосом, %	93,79 ± 1,22	94,72 ± 1,22	94,71 ± 1,22	95,79 ± 1,19
НСТ-спонтанный, % клеток	36,59 ± 1,51	35,59 ± 1,51	37,05 ± 1,51	37,09 ± 1,51
НСТ- спонтанный, у.е. / клетку	0,41 ± 0,05	0,45 ± 0,03	0,47 ± 0,03	0,47 ± 0,03
НСТ-индуциров., % клеток	60,24 ± 1,41	63,66 ± 1,62	67,47 ± 1,54 * †	60,67 ± 1,47
НСТ-индуциров. у.е. / клетку	0,69 ± 0,03	0,74 ± 0,033	0,76 ± 0,032	0,81 ± 0,030
Функциональный резерв	2,33 ± 0,13	2,54 ± 0,14	2,61 ± 0,13	2,66 ± 0,13
Активность фагоцитоза, % клеток	57,13 ± 1,50	60,49 ± 1,60	62,21 ± 1,57	64,01 ± 1,34
Интенсивность фагоцитоза, у.е. / клетку	1,81 ± 0,12	1,83 ± 0,17	1,84 ± 0,12	1,84 ± 0,09

Примечание. Здесь и далее * статистически значимые (р ≤ 0,05) различия по критерию Манна – Уитни с группой 1, # – с группой 2, ^ – с группой 3, † – с группой 4.

Таблица 2

Влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro (время экспозиции 20 мин)

Показатель Группа 1 (естественное освещение) Группа 2 (лампы накаливания) Группа 3 (лампы люминесцентные) Группа 4 (лампы светодиодные) Люминесценция лизосом, у. е. 285,81 ± 15,19 281,91 ± 12,00 287,81 ± 12,92 299,91 ± 11,71 Активность лизосом, % 83,22 ± 1,22 84,77 ± 1,00 84,91 ± 0,22 85,69 ± 1,09 НСТ- спонтанный, % клеток 26,49 ± 1,51 25,00 ± 1,33 35,05 ± 1,22 * # † 26,09 ± 1,09 НСТ-спонтанный, у.е. / клетку 0,37 ± 0,05 0,41 ± 0,034 0,39 ± 0,03 0,40 ± 0,026 НСТ-индуциров., % клеток 60,00 ± 1,56 61,22 ± 1,22 61,47 ± 1,00 61,67 ± 1,33 НСТ-индуциров., у.е. / клетку 0,59 ± 0,03 0,54 ± 0,033 0,56 ± 0,032 0,51 ± 0,013 Функциональный резерв 2,00 ± 0,13 2,04 ± 0,14 2,01 ± 0,13 2,06 ± 0,09 Активность фагоцитоза, % клеток 47,13 ± 1,36 50,49 ± 1,44 51,21 ± 1,67 50,01 ± 1,24 Интенсивность фагоцитоза, у.е. / клетку 1,61 ± 0,12 1,63 ± 0,67 1,64 ± 0,42 1,64 ± 0,29 нием, освещением лампами накаливания и светодиодными лампами. Результаты представлены в табл. 2.

При анализе данных, полученных после 30минутного воздействия света, генерируемого различными источниками на функциональную активность нейтрофилов также не выявлено статистически значимых различий по показателям активно- сти и интенсивности лизосомального аппарата нейтрофилов, фагоцитарной способности. Отмечены значимые изменения биоцидных возможностей нейтрофилов в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте (активность клеток) облучённых светом, генерируемым люминесцентными лампами по сравнению с естественным освещением (p = 0,05). Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Влияние различных источников света на функциональную активность нейтрофилов периферической крови в условиях in vitro (время экспозиции 30 минут)

Показатель	Группа 1 (естественное освещение)	Группа 2 (лампы накаливания)	Группа 3 (лампы люминесцентные)	Группа 4 (лампы светодиодные)
Люминесценция лизосом, у. е.	280,81 ± 14,19	277,91 ± 12,99	277,81 ± 12,00	280,91 ± 11,98
Активность лизосом, %	80,22 ± 1,02	81,77 ± 1,12	82,91 ± 0,22	83,69 ± 1,13
НСТ- спонтанный, % клеток	22,09 ± 1,51	23,00 ± 1,11	26,05 ± 1,09 * #	24,09 ± 1,12
НСТ- спонтанный, у. е. / клетку	0,27 ± 0,02	0,26 ± 0,004	0,27 ± 0,03	0,28 ± 0,016
НСТ-индуциров., % клеток	50,00 ± 1,16	51,22 ± 1,13	56,47 ± 1,20 * #	53,67 ± 1,00
НСТ-индуциров., у. е. / клетку	0,59 ± 0,03	0,54 ± 0,011	0,56 ± 0,02	0,51 ± 0,01
Функциональный резерв	2,10 ± 0,13	2,04 ± 0,14	2,19 ± 0,13	2,06 ± 0,19
Активность фагоцитоза, % клеток	27,13 ± 1,36	30,49 ± 1,44	31,21 ± 1,67	30,01 ± 1,24
Интенсивность фагоцитоза, у.е. / клетку	1,61 ± 0,12	1,63 ± 0,67	1,64 ± 0,42	1,64 ± 0,29

Таким образом, воздействие света, генерируемого лампами накаливания, светодиодными источниками света в пределах световой температуры 4000–4500 К, с интенсивностью излучения 0,03 Вт/м2 в диапазоне длин волн 320–400 нм в течение 10–30 мин не приводит к статистически значимому изменению функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, выделенных из периферической крови клинически здоровых лю-дей-добровольцев при сравнении с естественным освещением. Воздействие на нейтрофилы света люминесцентных ламп приводит к активации ки-слород-зависимого метаболизма по показателям активности НСТ-теста.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт № 14.516.11.0091 от 01.07.2013).