Сравнительный морфоколичественный анализ состояния генеративного аппарата яичников крыс после двухсторонней перевязки внутренних подвздошных артерий в условии фармакологической коррекции ксимедоном и мелатонином

Введение. Двухсторонняя перевязка внутренних подвздошных артерий (ВПА) предлагается в последние годы как один из самых эффективных методов остановки массивных маточных кровотечений, позволяющий сохранять фертильную и менструальную функции репродуктивных органов [3, 6, 8, 10].

Однако, несмотря на сравнительно быстрое, согласно данным экспериментальных исследований, восстановление гемодинамики и структурных нарушений в репродуктивных органах [9], в отдаленном послеоперационном периоде у женщин, перенесших двухстороннюю перевязку ВПА, в ряде случаев наблюдается гормональная дисфункция, требующая медикаментозной коррекции [11].

В условии двухсторонней перевязки ВПА, благодаря включению коллатерального кровоснабжения, ишемия в репродуктивных органах носит кратковременный характер, вслед за которой происходит реперфузия с реоксигенацией ткани. Известно, что чередование ишемии и реперфузии с реоксигенацией в ткани, провоцирует развитие оксидативного стресса с образованием свободных радикалов, оказывающих повреждающее воздействие на ткань [2,12].

Современные познания патогенетических аспектов свободнорадикального повреждения ткани позволяют использовать фармакологическую коррекцию структурно-функциональных нарушений в яичниках в условии двухсторонней перевязки ВПА и осуществлять их профилактику препаратами с антиоксидантным типом действия.

В доступной литературе нет данных по изучению и опыте использования названных препаратов при двухсторонней перевязке ВПА.

Перспективными в плане исследования представляются: гормон эпифиза - мелатонин и препарат пиримидинового ряда - ксимедон.

Доказана in vitro и in vivo высокая антиоксидантная активность названных препаратов: мелатонин обладает способностью принимать непосредственное участие в нейтрализации различных высокотоксичных свободных радикалов [1], а антиоксидантный эффект ксимедона выражен, по мнению исследователей, в мембраностабилизирующем действии [5]. Кроме того, в ряде работ показана способность мелатонина оказывать влияние на гипоталамо-гипофизарно-яичниковую систему в регуляции овариального цикла при развитии гормонального дисбаланса [4]. Ксимедон отличается высокой репаративной активностью, что позволяет использовать его в клинической практике при заживлении ран, ожогов, трофических язв и др. [5].

Цель исследования - дать сравнительную морфоколичественную оценку влияния мелатонина и ксимедона на изменение генеративного аппарата яичников крыс в условии двухсторонней перевязки ВПА.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на материале 168 нелинейных белых крысах-самках в возрасте 6-12 месяцев, массой 220-250 г.

Экспериментальная часть исследования включала 2 серии:

В первой серии эксперимента животным под уретановым наркозом (800 мг/кг внутрибрюшинно) производилась двухсторонняя перевязка ВПА (n=144).

Во второй серии экспериментального исследования животным вводились лекарственные препараты ксимедон и мелатонин.

В связи с этим все экспериментальные животные были ранжированы на 4 группы.

В первую группу (n=24) были выделены интактные животные, которые служили контролем в исследовании.

Во вторую группу (n=48) вошли животные, которым после двухсторонней перевязки ВПА не вводились препараты. Эта группа животных была использована в качестве группы сравнения.

В третью группу (n=48) выделены животные, которым после двухсторонней перевязки ВПА в течение 30 суток ежедневно внутрибрюшинно вводился ксимедон из расчета 25 мг/кг массы животного.

Четвертой группе животных (n=48) после двухсторонней перевязки ВПА в течение 3 месяцев с питьевой водой давали мелатонин из расчета 2 мг/л.

Эксперимент длился 180 суток. Крыс выводили из эксперимента на 3, 7, 14, 30, 90, 180 сутки после проведенной двухсторонней перевязки ВПА методом декапитации под уретановым наркозом в стадию диэструса. Для определения фазы эстрального цикла производили цитологическое исследование влагалищных мазков [3].

Материалом для исследования явились яичники крыс-самок.

Отпрепарированные яичники заливали в парафин. На серийных гистологических срезах толщиной 6—7 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином с помощью окуляр-микрометра проводилась количественная оценка состояния генеративного аппарата яичников крыс. Подсчитывали число фолликулов и желтых тел. Все фолликулы были разделены на 3 группы: к первой группе относили примордиальные фолликулы – фолликулы с одним рядом плоских эпителиальных клеток и с одним рядом кубических эпителиальных клеток, во вторую группу были отнесены растущие фолликулы всех размеров, и в третью группу вошли все атретические фолликулы. Об атрезии судили по отсутствию митозов в клетках гранулезной оболочки, по выпадению гранулезы в полость фолликула, по отслойке этой оболочки от внутренней теки, появлению в ней очагов дегенерации, по исчезновению блестящей оболочки и по хроматолизу. Подсчет генеративных элементов производился на серийных срезах через каждые

Таблица.

Содержание генеративных элементов в срезах яичников крыс при двухсторонней перевязке ВПА и в условии фармакологической коррекции мелатонином и ксимедоном (М±m)

Генеративные элементы	Интактный контроль	Сроки эксперимента
		14 сутки	30 сутки	90 сутки	180 сутки
Двухсторонняя перевязка ВПА
ПФ	6,78±0,29	7,37±0,52	5,12±0,43*	3,47±0,69*	4,94±0,29*
РФ	7,32±0,48	6,64±0,43	4,25±0,47 *	3,65±0,67 *	4,98±0,44 *
АФ	4,34±0,27	4,89±0,22	6,12±0,08*	11,65±1,83*	8,35±0,56*
ЖТ	5,94±0,54	5,24±0,35	4,28±0,54*	3,06±0,48*	4,64±0,47*
Двухсторонняя перевязка ВПА+мелатонин
ПФ	6,78±0,29	6,34±0,32	5,64±0,12	6,24±0,23#	6,69±0,34*#
РФ	7,32±0,48	6,85±0,76	5,48±0,19#	6,97±0,87#	7,74±0,87*#
АФ	4,34±0,27	4,74±0,43	5,58±0,34#	5,15±0,89#	4,75±0,78*#
ЖТ	5,94±0,54	5,32±0,31	4,45±0,65	4,94±0,56#	5,87±0,67*#
Двухсторонняя перевязка ВПА+ксимедон
ПФ	6,78±0,29	6,38±0,65	5,22±0,65#	4,24±0,78#	5,45±0,64*#
РФ	7,32±0,48	6,78±0,43#	5,16±0,45#	5,43±0,54#	6,03±0,53*#
АФ	4,34±0,27	4,65±0,12	6,07±0,76	9,34±0,93#	6,34±0,23*#
ЖТ	5,94±0,54	5,55±0,39#	4,89±0,56#	4,23±0,39#	4,97±0,45*#

Примечание: * - при сравнении с животными интактной группы (р<0,05); # - при сравнении с группой животных, не получавших препараты после двухсторонней перевязки ВПА (р<0,05); ПФ-при-мордиальные фолликулы, РФ-растущие фолликулы, АФ-атретические фолликулы, ЖТ-желтые тела.

150-200 мкм ткани яичника в каждом пятом срезе.

Статистическая обработка материала выполнена с использованием прикладных программ: Microsoft Windows (Microsoft Office Excel 2007) с вычислением средних арифметических величин (М), стандартных ошибок средних (m) и t-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. При морфометрическом исследовании срезов яичников крыс установлено, что после перевязки ВПА у животных уже к 30 суткам наблюдения происходит постепенное уменьшение числа примордиальных фолликулов, достигая к 90 суткам эксперимента своего минимального значения - 3,47±0,69 ( р <0,05), в то время как в интактном контроле оно составляет 6,78±0,29. При этом обращает на себя внимание тот факт, что у крыс к 14 суткам после перевязки ВПА содержание примордиальных фолликулов в срезах яичников на 10,9% превышал таковое в контроле. В отдаленном послеоперационном периоде (180 суток) наблюдается тенденция к увеличению числа примордиальных фолликулов, однако, это число остается сниженным на 27,1% в сравнении с интактным контролем (табл.).

Похожая тенденция складывалась и в от- ношении растущих фолликулов. Количество растущих фолликулов в срезах яичников крыс в 2 раза уменьшается к 90-м суткам эксперимента, что отражает наиболее выраженные нарушения фолликулогенеза яичников на данном сроке послеоперационного периода. Неполноценность фолликулогенеза сохранялась до 180 суток после двухсторонней перевязки ВПА, о чем свидетельствует сниженное на 31,9% в сравнении с интактным контролем число растущих фолликулов.

Наиболее отчетливо нарушение фоллику-логенеза демонстрирует динамика изменения численной плотности желтых тел – конечного результата эффективного фолликулогенеза. В постоперационном периоде после двухсторонней перевязки ВПА происходило прогрессирующее снижение этого показателя в сравнении с контролем: к 14-м суткам на 11,8%, к 30 -мсуткам на 27,9%, что свидетельствует о «разорвавшейся» цепи фолликулогенеза в результате некроза и апоптоза клеток гранулезы в этот период. Минимальные значения численной плотности желтых тел на срезах яичников крыс с двухсторонней перевязкой ВПА были выявлены на сроке 90 суток наблюдения (на 48,5% ниже контрольного значения), что обусловлено сохраняющимися существенными нарушениями гормонально опосре- дованного процесса трансформации фолликулов яичников. В эксперименте большинство желтых тел неправильной формы, находящихся в стадии инволюции, что указывает на снижение числа созревших и вышедших из фолликулов ооцитов. К 180 суткам послеоперационного периода количество желтых тел оставалось сниженным на 21,9% в сравнении с интактным контролем.

Другим критерием функционального состояния яичников является интенсивность процесса атрезии фолликулов. Нами установлено, что у животных после двухсторонней перевязки ВПА интенсивность процесса атрезии растущих фолликулов постепенно увеличивается с 30 суток эксперимента, при этом число атретических фолликулов к 90 суткам послеоперационного периода в срезах яичников достигало до 11,65±0,83, в то время как в интактном контроле оно составило - 4,34±0,27 ( р <0,05). К 180 суткам число атретических фолликулов было почти вдвое выше интактного контроля (8,35±0,56, р <0,05). Атрезия проходила как по типу облитерирующей, так и по типу кистозной. Наличие кистозной атрезии свидетельствует о патологических сдвигах в гормональном статусе животных.

На фоне введения ксимедона и мелатонина после двухсторонней перевязки ВПА в срезах яичников белых крыс выявлялось достоверное увеличение числа примордиальных и растущих фолликулов с 30 суток послеоперационного периода. Сравнивая срезы яичников животных, получавших ксимедон и животных, получавших мелатонин после двухсторонней перевязки ВПА, получены результаты, позволяющие утверждать, что оба препарата достоверно оказывают положительное влияние на восстановление структурности яичников и способствуют улучшению процесса фолликуло- и лютеогенеза. Однако мелатонин в сравнении с ксимедоном оказывает более выраженное протективное действие на структуру яичников.

Наиболее показательна протективная активность препаратов прослеживается с 90 суток исследования: число первичных и растущих фолликулов в срезах яичников в сравнении со 2-ой группой экспериментальных животных при введении ксимедона увеличилось на 22,1% и 48,7% соответственно, а при введении мелатонина на 79,8% и 102% соответственно (табл.).

Показатели лютеогенеза в яичниках крыс, подвергшихся воздействию мелатонина после двухсторонней перевязки ВПА, к 180 суткам эксперимента приближались к таковым показателям интактного контроля, а на фоне введения ксиме-дона число желтых тел в срезах яичников на том же сроке эксперимента было сниженным на 16,3% в сравнении с интактным контролем.

Показатели снижения атрезии яичников животных, получавших ксимедон после двухсторонней перевязки ВПА, были менее информативны в сравнении с показателями животных, получавших мелатонин: число атретических фолликулов снизилось к 90 суткам эксперимента на фоне введения мелатонина на 55,8%, а на фоне введения ксимедона лишь на 19,8%. А к 180 суткам количество атретических фолликулов снизилось на 43,1% и 24,1% соответственно, в сравнении с 2-ой группой экспериментальных животных.

Таким образом, проведенное исследование показало, что при двухсторонней перевязке ВПА развивается нарушение фолликулогенеза и лю-теогенеза, выражающееся снижением примордиальных, растущих фолликулов и желтых тел с одновременным увеличением числа атретических фолликулов. Увеличение числа примордиальных и растущих фолликулов и снижение активности атретических процессов в яичниках на фоне введения препаратов с антиоксидантной активностью - мелатонина и ксимедона подтверждает оксидативную природу повреждающего фактора при двухсторонней перевязке ВПА. Мелатонин проявляет наибольшую активность и способствует полному восстановлению фолликулогенеза и лютеогенеза к 180 суткам наблюдения, в то время, как ксимедон не показал подобные результаты. Это обусловлено, вероятно, участием мелатонина в регуляции биоритмов в организме животных и способностью оказывать влияние на гипоталамо-гипофизарно-яичниковую систему. Восстанавливая дисбаланс в гормональном статусе животных, мелатонин способствует восстановлению структурной организации генеративных элементов яичников.