Стабильная трансфекция нескольких плазмидных векторов посредством транспозонной системы "Sleeping beauty"

Трансфекция. За 5 часов до трансфекции клеточную среду меняли. Клетки трансфицировали с использованием TurboFect (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя. Плазмиды были смешаны в отношении 1:1:6 соответственно pSB-IR-CAG-BleoR-T2A-eGFP : pSB-IR-CAG-BleoR-T2A-mCherry : pCMV(CAT)T7-SB100. Плаз- мидную ДНК для трансфекции выделяли при помощи набора Наборы Plasmid Miniprep (Evrogen, Россия) получали, в соответствии с протоколом производителя. Через двое суток среду меняли и добавляли среду с антибиотиком зеоцин для селекции в концентрации 100 мкг/мл.

Проточная цитометрия. Клетки отделяли от поверхности 24-луночного планшета при помощи раствора 0,25% трипсина (Панэко, Россия) и раствора Версена (Панэко, Россия), промывали и ресуспен-дировали в растворе Дюльбекко (Панэко, Россия). Образцы анализировали с использованием проточного цитометра FACSCalibur (BD, США), используя канал FL1 и FL2. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Flowing Software 2. Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для множественной стабильной трансфекции нами было использовано две плазмиды с генами флуоресцентных белков eGFP и mCherry и геном устойчивости к антибиотику Zeocin (рис. 1).

Рис. 1. Генетические карты плазмид, используемых для стабильной трансфекции

Флуоресцентные белки позволяют легко идентифицировать клетки со стабильной трансформацией, а ген устойчивости к антибиотику позволяет провести селекцию клетки, в которых произошла стабильная интеграция. Плазмида, содержащая белок eGFP (pSB-IR-CAG-BleoR-T2A-eGFP) и плазмида, содержащая белок mCherry (pSB-IR-CAG-BleoR-T2A-mCherry) были трансфицированы в клетки HEK293T вме- сте с плазмидой, содержащей транспозон (pCMV(CAT)T7-SB100), после чего клетки, селектировались на стабильную трансформацию антибиотиком Zeocin. В качестве контроля использовалась смесь плазмид без SB100X. Полученные клеточные линии анализировались при помощи проточной цитометрии, результаты которой представлены на рисунке 2.

Рис. 2. Дот-плот распределения клеток по уровню флуоресценции зеленого цвета (FL1) и красного цвета (FL3), а) популяция клеток с использованием SB100X, б) популяция клеток без использования SB100X

Из рисунка видно, что в случае использования SB100X 29% всей популяции клеток флуоресцировали и зеленым и красным цветом, 50% популяции клеток – флуоресцировали только одним цветом и 22% не флуоресцировали. Если же SB100X не использовалась, то только около 8% популяции клеток флуоресцировали обеими цветами, 47% клеток флуоресцировали один цветом и 45% не флуоресцировали. Отсутствие флуоресценции в части популяции клеток, по-видимому, связано с тем, что уровень флуоресценции в данных клетках низкий и не может быть детектирован при помощи проточной цитометрии, либо экспрессия флуоресцентных белков прекратилась из-за эпигенетического сайленсинга. Флуоресценция клеток обоими цветами свидетельствует о том, что в геном данных клеток интегрировались обе плазмиды. Поэтому в случае использования SB100X 29% клеток подвергается множественной стабильной трансфекции, в то время как без использования SB100X только 8% клеток подвергается множественной стабильной трансфекции. Эти данные позволяет утверждать, что трансфекция с использованием SB100X позволяет получать стабильные клеточные линии содержащие вставки в геном из нескольких источников.

Таким образом, транспозон SB100X значительно увеличивает одновременную интеграцию обоих плазмид в геном, поэтому транспозонная система «Sleeping Beauty» может быть использована для тех случаев, когда требуется получение клеточной содержащей несколько трансгенных белков.