Стандартизация и рациональное использование сырья и препаратов прополиса

Перспективным источником противовоспалительных, антимикробных и регенерирующих лекарственных средств является продукт совместной жизнедеятельности пчел и растений (тополь, ива и др.) – прополис (Р. № 95/335/910, ВФС 421084-81) [1-5, 7-9]. Продукт пчеловодства животного происхождения прополис и его источники – растения семейства Ивовых ( Salicaceae ), в частности, виды рода тополь ( Populus L.), широко используются в народном хозяйстве как источники ценной древесины для строительства, производства столярных изделий, и др. В настоящее время в России находятся большие сырьевые запасы видов рода Populus L., но так как непрерывно растёт спрос на древесину, они быстро сокращаются. Создание быстрорастущих плантаций кроме экономического эффекта – важный социальный аспект [10]. При рубке леса побеги и почки деревьев являются отходами производства и практически не используются [10].

В медицинской практике широко используется лекарственное средство «Прополиса настойка» (Р. № 90/111/3, ФС 42-3736-99) [1, 2, 4, 6, 8, 9]. Использование в физиотерапии электрофореза с прополисом оказывает обезболивающий и противовоспалительный эффекты при лечении стоматологических заболеваний пародонтопатий, при острых и обостренных хронических периодонтитах, в гинекологии, а также для фонофореза; в отоларингологии при лечении нейросенсорной тугоухости – наружно для проведения фонофореза прополиса на растительном масле [1, 2, 4, 6, 8, 9].

Шаталаев Иван Федорович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой химии фармацевтического факультета

Актуально совершенствование определения подлинности и доброкачественности препаратов прополиса на основе современных данных о компонентном составе биологически активных соединений (БАС). В препаратах прополиса, как и в почках тополя, антимикробную активность обусловливают флавоноиды и фенилпропаноиды [1-2, 4, 7-9]. Ранее было установлено, что стандартизацию сырья «Тополя почки «ангро»» (ФСП 4203291682-01), препаратов тополя «Тополя настойка» (ФСП 42-03291747-01) и прополиса целесообразно проводить по содержанию суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в пересчете на государственный стандартный образец (ГСО) пиностробина (Р. № 001373/01, ФС 42-0073-01). Показана перспективность использования метода ВЭЖХ для стандартизации почек тополя, прополиса и их препаратов [1, 5, 8]. Однако в сырье прополиса и настойке (ВФС 42-1936-89) ранее определяли не флавоноиды, а простые фенолы неспецифической реакцией с солями железа [1]. Качественный анализ настойки прополиса (ФС 423736-99) в настоящее время представлен более специфичной цианидиновой реакцией на флавоноиды. Ранее была показана целесообразность использования тонкослойной хроматографии (ТСХ) и УФ-спектрофотометрии с использованием ГСО пиностробина (Рег. № 001373/01-2002, ФС 420073-01) для стандартизации сырья прополиса и почек тополя [1]. Актуальным является рациональное использование в медицинской практике прополиса и препаратов на его основе, что позволяет также снизить сырьевую нагрузку на его растительные источники (тополя, ивы, березы и др.).

Цель исследований: проведение сравнительных фитохимических и аналитических исследований для стандартизации и обоснования целесообразности использования в медицинской практике препаратов на основе прополиса и его растительных источников.

Объекты и методы. Сравнительному исследованию подвергались образцы сырья прополиса из различных регионов России и образцы почек тополя ( Populus L.), семейства Ивовых ( Salicaceae ), заготовленные в 2005-2011 гг. Кроме того, объектами исследования служили отечественные заводские образцы лекарственного средства «Прополиса настойка» серийного производства 2010-2012 гг.

Проведено сравнительное исследование образцов прополиса и тополя почек методом электрофореза в полиакриламидном геле. Для электрофореза настаивание образцов сырья проводили 20% спиртом этиловым в соотношении «сырье: экстрагент» 1: 50 при комнатной температуре в течение 48 часов в защищенном от света месте. Полученное извлечение фильтровали через бумажный фильтр с красной полосой. Анализируемые образцы в объеме 0,5 мл в смеси с 40% раствором сахарозы наносили на линию старта. Электрофоретическое определение молекулярных форм проводили в 7,5% полиакриламидном геле, состоящем из 2 гелей: концентрирующего (верхний слой) и разделяющего (нижний слой) – в трис-ЭДТА-боратном буфере при рН=9,0. При данной величине водородного показателя раствора в системе нами было отмечено эффективное разделение исследуемых белков на молекулярные фракции. Электрофорез вели при постоянном токе в два этапа: первый этап способствует образованию тонких пространственных слоев однородных по молекулярной массе молекул. Плотность тока ∆I=5 мА/см, продолжительность 30 минут. Второй этап электрофореза является собственно разделяющим, позволяющий полученные области концентрирования разделить пространственно в структуре геля. Плотность тока 10 мА/см, продолжительность – до окончания электрофореза. В качестве индикатора окончания процесса разделения был выбран краситель бромфеноловый синий. При данном значении рН молекула индикатора приобретает эффективный отрицательный заряд, благодаря которому, а также размеру молекулы фронт данного вещества приходит на линию «финиша» первым. Полученные фракции белков окрашивали и фиксировали, для чего экспресс-окрашивание фракции белков и фиксацию электрофореграмм проводили следующим способом: по окончании электрофореза катодную камеру прибора заливали 1%-ным раствором амидо черного в 7% уксусной кислоте и продолжали процесс фореза в течение 10 мин. После окрашивания гелей раствор красителя заменяли 7%-ным раствором уксусной кислоты и продолжали электрофорез до полного удаления фонового окрашивания.

Для изучения прополиса использовали методы УФ-спектроскопии, ТСХ и ВЭЖХ. Регистрацию электронных спектров проводили на спектрофотометре «Specord 40» (Analytik Jena). Изучение компонентного состава прополиса проводили при помощи ТСХ, обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе «Милихром-5».

Результаты и их обсуждение. В результате сравнительного исследования компонентного состава флавоноидов и фенилпропаноидов почек видов тополя и прополиса было установлено, что доминирующими компонентами почек видов тополя и прополиса являются флавоноиды и фенил-пропаноиды. Оптимальной системой для хроматографирования подобрана малополярная система растворителей хлороформ-этиловый спирт в соотношении 9:1, так как ведущие БАС, получаемые на 80% этаноле прополиса настойки – флавоноиды являются малополярными агликонами. На хроматограмме исследованных образцов прополиса настойки обнаруживается диагностическое пятно фиолетовой флюоресценции в УФ-свете (254 нм), жёлто-оранжевого цвета после проявления щелочным раствором диазобензолсульфокислоты на уровне пятна ГСО пиностробина ( Rf около 0,8). Таким образом, получены данные сравнительного исследования серийных образцов лекарственного препарата «Прополиса настойка» методом ТСХ, разработаны новые подходы к объективному контролю подлинности препаратов прополиса методом ТСХ с использованием ГСО пиностробина.

Для почек тополя, прополиса и их препаратов разработана реакция подлинности методом ТСХ с использованием ГСО пиностробина. На электрофореграмме обнаружены фракции белка с молекулярной массой от 3 до 5 тыс. дальтон. Относительная электрофоретическая подвижность Rf образцов сравнима и находится в интервале от 0,2 до 0,4. Более легкие фракции белка проявились у образцов почек тополя душистого, черного, бальзамического и канадского, а также у большинства образцов прополиса. Более тяжелые фракции белка проявились у почек осины и образцов прополиса из Ульяновской области и горного Туапсинского района Краснодарского края. Полученные данные электрофореза позволяют предположить, что обнаруженные белки образцов прополиса являя-ются маркерными белками различных типов прополиса. Электрофорез в полиакриламидном геле предлагается нами как новый перспективный метод стандартизации лекарственного сырья прополиса и почек тополя, а также препаратов на их основе.

Максимумы поглощения в УФ-спектрах водно-спиртовых извлечений прополиса, почек тополя (290 нм), спиртовых растворов пиностро-бина (289 нм) и батохромный сдвиг максимума поглощения комплекса с AlCl3 в область 310 нм свидетельствуют, что характер кривой поглощения определяется флавононами. Исследованные образцы прополиса преимущественно «тополиного» или смешанного типа. В горном Туапсинском районе Краснодарского края образцы прополиса «осинового типа». УФ-спектр рекомендуется для определения подлинности сырья и препаратов прополиса. Количественное определение суммы флавоноидов и фенилпропаноидов в прополисе проводили спекрофотометрическим методом с использованием ГСО пиностробина (в сырье должно быть не менее 10%). В методе ВЭЖХ подобраны 2. условия разделения компонентов прополиса.

Разрабатываемые методики анализа рекомендуется включить в НД на сырьё и препараты прополиса, что позволит создать основу для рас- ^. ширения ассортимента отечественных лекарст- 4. венных средств и рационального использования природных ресурсов с целью сохранения экологического равновесия.                              ^5.

Выводы:

• 1.    Результаты сравнительного изучения химии-ческого состава флавоноидов и фенилпропаноидов почек тополя и прополиса положены в основу 6. качественного и количественного анализа препаратов прополиса.

• 2.    Разработаны подходы к стандартизации на основе современных методик качественного и ^. количественного анализа (ТСХ, УФ-спектрофотометрии, электрофорез) препаратов прополиса с 8. использованием ГСО пиностробина.

• 3.    Показаны пути рационального использования ресурсов сырья животного происхождения прополиса и его растительных источников.