Статистический анализ аминокислотного состава уролитов жителей Республики Коми

Уролиты (мочевые камни) представляют собой патогенные органоминеральные образования, встречающиеся в мочевыводящих путях и развивающиеся вследствие мочекаменной болезни. По химическому составу они обычно разделяются на уратные, оксалатные и фосфатные. Мочевые камни мономинерального состава встречаются редко, чаще они имеют смешанный состав, а их принадлежность к тому или иному типу устанавливается по преобладанию минеральной фазы [1].

За последнее десятилетие заболеваемость уролитиазом (мочекаменной болезнью) в Республике Коми неуклонно растет и значительно превышает общероссийские показатели. По данным Госкомстата и Минздрава России, показатель заболеваемости по Республике Коми составил 8,52 случая на 1000 чел., а в целом по Российской Федерации 5,98 случаев на 1000 чел. [2]. При исследовании 90 мочевых камней, полученных от жителей Республики Коми, установлено, что на долю оксалатных уролитов приходится 67 %, фосфатных – 22 % и уратных – 11 %. В настоящее время отсутствует единая точка зрения на природу уролитиаза [3], при этом понимание данного сложного механизма приведет к разработке новой стратегии профилактики и лечения этого заболевания. Исследования последних лет показали, что немалую роль в процессах формирования и роста мочевых камней играет органическое вещество [4, 5]. Непосредственно в уролитах содержание органической компоненты составляет 2–5 мас. %, причем основная ее масса приходится на долю белков, локализация которых в структуре патогенного биоминерального образования крайне неоднородна [5, 6]. В литературе имеются лишь единичные данные о составе аминокислот (АК) белковых соединений уролитов различного типа [7 - 10]. Предпринимались отдельные попытки обнаружения связи между минеральной составляющей мочевых камней и качественным и количественным составом АК и белков [8, 9, 11 - 13]. Однако в целом эти исследования не позволяют однозначно утверждать о существовании взаимосвязи между аминокислотным составом уролитов и их химическим составом. Более того, исследования аминокислотного состава различных биоминералов в организме человека показали, что они формируются в условиях повышенного содержания одного и того же набора аминокислот, выполняющих роль структурообразующих компонентов в генезисе патогенных твердых образований [8]. Владея методологией различных научных направлений, возможно обеспечить прогресс в решении вопросов роста заболеваемости уролитиазом.

В задачи работы входило установление аминокислот, показывающих статистически значимые отличия уролитов разных типов, и выявление статистически значимых различий между априорно заданными типами мочевых камней по нескольким наиболее информативным АК одновременно.

Материал и методы

Нами проведено изучение аминокислотного состава 28 образцов уролитов, из которых 8 – ураты (мочекислые), состоящие из мочевой кислоты (С 5 Н 4 N 4 O 3 ), 8 – оксалатсодержащие (уэвеллит – СаС 2 О 4 ·Н 2 О, уэдделлит – СаС 2 О 4 · 2Н 2 О) и 12 – фосфатные (струвит – MgNH 4 PO 4 · 6H 2 O, карбонатсодержащий гидроксилапатит с идеальной формулой Са 10 (PO 4 СО 3 ) 6 (ОН) 2 ). Определялся состав 14 аминокислот: аланин (Ala), валин (Val), глицин (Gly), изолейцин (Ile), лейцин (Leu), лизин (Lys), аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu), треонин (Thr), серин (Ser), фенилаланин (Phe), тирозин (Tyr), пролин (Pro) и метионин (Met). Идентификация и определение содержания аминокислот в образцах выполнены на газовом хроматографе GC-17A (Shimadzu, капиллярная колонка Chirasil-L-Val). Для извлечения аминокислот из образцов применяли кислотный гидролиз в 6М HCl при 105 ° С в течение 12 час. Выделенные из гидролизата аминокислоты очищали от примесей и переводили в N-пентафторпропионовые изопропиловые эфиры соответствующих аминокислот. Подробно методика определения аминокислотного состава описана в работе [14].

Следует отметить, что общее содержание АК для каждого типа уролитов варьирует в одних и тех же пределах (11–33 мг/г в уратных, 11–29 мг/г в фосфатных и 13–34 мг/г в оксалатных), что, по-видимому, связано с различным содержанием в них белковой компоненты. Как показали проведенные исследования, состав индивидуальных аминокислот в них довольно схож и не позволяет наглядно различать отдельные типы мочевых камней.

Для выявления взаимосвязи минеральной фазы с аминокислотным составом нами были привлечены статистические методы исследования с использованием программного продукта Statistica 6.0. Применялись одномерные (критерии Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни и непарный критерий Стьюдента) и многомерные методы (деревья классификации и дискриминантный анализ). Статистическая оценка проводилась для заданного критического уровня значимости р=0,05. Ранее подобные исследования были выполнены нами для сравнительного группирования углеродистых веществ по аминокислотному составу [15]. Статистический анализ данных проводился по относительным процентным содержаниям АК в виду вышеописанного неравномерного распределения белковой компоненты в уролитах.

Результаты и обсуждение

Сначала проведена проверка распределений содержаний аминокислот на нормальность для каждого типа уролитов с помощью описательной статистики, графически и с применением статистических критериев. Для этого использовались критерии Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса (статистика d) и Шапиро-Уилка (статистика W), оце- нивались коэффициенты асимметрии A и эксцесса E (абсолютные значения не превосходят единицы), нормальные вероятностные графики, частотные гистограммы распределения с кривой нормального распределения. В результате проведенных исследований установлено, что для уролитов, состоящих из мочевой кислоты, близкое к нормальному имеют распределения Val (W = 0,903; p = 0,306; d = 0,201; p > 0,20; A = 0,67; E = -0,37), Ser (W = 0,954; p = 0,751; d = 0,128; p > 0,20; A = -0,81; E = 0,65), Phe (W = 0,970; p = 0,901; d = 0,149; p > 0,20; A = -0,69; E = 0,38), Tyr (W = 0,981; p = 0,965; d = 0,150; p > 0,20; A = -0,09; E = -0,65), для фосфатных – Ala (W = 0,986; p = 0,998; d = 0,101; p > 0,20; A = 0,22; E = 0,22), Val (W = 0,940; p = 0,503; d = 0,160; p > 0,20; A = 0,19; E = -0,21), Ile (W = 0,960; p = 0,791; d = 0,128; p > 0,20; A = 0,01; E = -0,25), Leu (W = 0,959; p = 0,767; d = 0,170; p > 0,20; A = -0,40; E = -0,57), Glu (W = 0,875; p = 0,075; d = 0,177; p > 0,20; A = 0,74; E = 0,21), Lys (W = 0,988; p = 0,999; d = 0,087; p > 0,20; A = 0,12; E = -0,66), для оксалатных – Leu (W = 0,980; p = 0,961; d = 0,151; p > 0,20; A = -0,19; E = 0,50), Asp (W = 0,958; p = 0,792; d = 0,148; p > 0,20; A = 0,59; E = -0,02), Glu (W = 0,918; p = 0,410; d = 0,259; p < 0,15; A = 0,83; E = 0,002), Lys (W = 0,947; p = 0,683; d = 0,151; p > 0,20; A = -0,10; E = -0,46). При более строгом условии для коэффициентов асимметрии и эксцесса (абсолютное значение не более 0,5) число аминокислот, имеющих нормальное распределение, для разных типов будет меньше или вообще сведётся к нулю, например для мочекислых.

Поскольку ни одна из рассмотренных аминокислот не имеет нормального распределения одно- временно для всех трех типов уролитов, для проверки наличия или отсутствия различия по ним мочевых камней разных типов использовался непараметрический статистический критерий Краскела-Уоллиса. Установлено, что мочевые камни статистически значимо различаются по Gly (H = 15,086; p = 0,0005), Ile (H = 6,542; p = 0,038), Asp (H = 6,993; p = 0,030), Glu (H = 15,572; p = 0,0004), Lys (H = 6,469; p = 0,039). Так как критерий Краскела-Уоллиса показывает только наличие или отсутствие различия между несколькими независимыми группами объектов, но не показывает, какие именно группы объектов различаются, далее был применен критерий Манна-Уитни (непараметрический статистический метод сравнения двух независимых групп объектов по одному признаку). При сравнении двух типов уролитов по АК, имеющим распределения близкие к нормальному для обоих типов, был использован параметрический непарный критерий Стьюдента. Для попарного сравнения трёх независимых групп образцов – мочекислых, фосфатных, оксалатных – использовался скорректированный критический уровень значимости, равный 0,017. Применение прежнего уровня значимости 0,05 при попарном сравнении трёх типов образцов будет неправильно [16]. Установлено, что по относительным содержаниям Gly и Glu фосфатные и оксалатные образования статистически значимо отличаются от уратных (мочекислых), но не различаются между собой (табл. 1). Уратные характеризуются высоким относительным содержанием Gly (от 8,9 до 36,0 %) и низким относительным содержанием Glu (от 8,9 до 12,3 %) по сравнению с оксалатными (Gly – 4,2-7,6 %, Glu – 12,0-20,9 %) и фосфатными (Gly – 5,3-13,1 %, Glu –

Таблица 1

Результаты расчётов критерия Манна-Уитни и медианных значений относительных содержаний аминокислот в уролитах

Table 1

Results of calculations of Mann-Whitney test and median values of relative contents of amino acids in uroliths

Аминокислота	Медианные значения относительных содержаний аминокислот в уролитах			С равниваемые типы уролит ов
				Уратные (n 1 =8) и фосфатные (n 2 =12)			Уратные (n 1 =8) и оксалатные (n 2 =8)			Фосфатные (n 1 =12) и оксалатные (n 2 =8)
	Уратные	Фосфатные	Оксалатные	U	Z	p	U	Z	P	U	Z	p
Ala	5,716	7,974	10,366	27,0	-1,620	0,105	17,0	-1,575	0,115	45,0	-0,231	0,817
Gly	17,872	6,862	5,619	10,0	2,932	0,003	0,0	3,361	0,0008	24,0	1,852	0,064
Val	5,135	5,725	4,642	29,0	-1,466	0,143	27,0	0,525	0,600	38,0	0,772	0,440
Ile	2,947	4,109	2,772	23,0	-1,929	0,054	32,0	0,0	1,0	18,0	2,315	0,021
Leu	9,123	11,059	9,040	23,0	-1,929	0,054	29,0	-0,315	0,753	24,0	1,852	0,064
Thr	5,686	5,308	5,251	42,0	0,463	0,643	27,0	0,525	0,600	46,0	-0,154	0,877
Ser	7,002	6,040	5,435	35,0	1,003	0,316	13,0	1,995	0,046	26,0	1,697	0,090
Asp	9,073	12,229	13,538	14,0	-2,623	0,009	14,0	-1,890	0,059	45,0	-0,231	0,817
Glu	11,259	15,958	15,162	2,0	-3,549	0,0004	1,0	-3,256	0,001	39,0	0,694	0,487
Pro	6,009	5,158	7,394	28,0	1,543	0,123	22,0	-1,050	0,294	22,0	-2,006	0,045
Phe	4,993	6,145	4,905	22,0	-2,006	0,045	32,0	0,0	1,0	22,0	2,006	0,045
Tyr	5,897	4,189	1,541	29,0	1,466	0,143	14,5	1,838	0,066	30,0	1,389	0,165
Lys	6,341	8,011	5,465	31,0	-1,312	0,190	17,0	1,575	0,115	18,0	2,315	0,021
Met	0,202	0,0	0,269	38,0	0,772	0,440	31,0	0,105	0,916	33,0	-1,157	0,247

Примечание. n_1, n₂ - количества образцов уролитов соответствующего типа, U - значение критерия Манна-Уитни, p - достигнутый уровень значимости.

Note. n 1, n 2 - number of samples of uroliths of each type, U - value of the Mann-Whitney test, p – achieved level of significance.

12,2-22,6%). По содержанию Asp статистически значимо различаются только уратные и фосфатные. Мочекислые уролиты имеют более низкие относительные содержания Asp (5,4–14,6 %), чем фосфатные (9,6–22,4 %). По содержанию Lys статистически значимо различаются только фосфатные и оксалатные конкременты (t= 2,946, df = 16,482, p = 0,009), но не остальные пары мочевых камней (таблицы 1, 2). Для фосфатных образований характерны более высокие относительные содержания Lys (3,4–13,2 %) по сравнению с образцами, состоящими из оксалата кальция (3,3–7,3 %). Относительные содержания Lys в уратных образцах варьируют от 5,1 до 9,3 %. Следует отметить, что ни одна аминокислота не различает попарно все три типа мочевых камней (для уровня значимости 0,017).

риц ковариаций) выполнены, то правильнее использовать дискриминантный анализ. Метод деревья классификации показал 100 %-ную правильную классификацию всех 28 образцов мочевых камней для всех типов ветвления, реализованных в программе Statistica 6.0 (дискриминантное одномерное ветвление для категориальных и порядковых предикторов, полный перебор для одномерных ветвлений по методу C&RT, дискриминантное ветвление по линейным комбинациям порядковых предикторов), с условием прекращения ветвлений - прямая остановка и априорными вероятностями (0,67 – оксалатные, 0,22 – фосфатные, 0,11 – уратные), заданными с учетом исходных частот встречаемости разных типов уролитов у жителей Республики Коми. Так, дерево классификации, полученное дис-

Таблица 2

Результаты расчётов непарного критерия Стьюдента и критерия Левена проверки равенства дисперсий

Results of calculations of unpaired Student’s t-test and Levene’s test for equality of variances

Table 2

Аминокислота	X j	X 2	s 1	s 2	Левена F(1,df)	df	p Левена	t	df	p двуст.
Группа 1: уратные (n 1 =8), группа 2: фосфатные (n 2 =12)
Val	5,15	5,75	0,44	1,32	3,54	18	0,076	-1,215	18	0,240
								-1,437	14,46	0,172
Группа 1: фосфатные (n 1 =12), группа 2: оксалатные (n 2 =8)
Leu	10,55	9,22	1,58	1,40	0,62	18	0,440	1,938	18	0,069
								1,988	16,42	0,064
Glu	16,33	15,77	3,43	2,92	0,07	18	0,795	0,380	18	0,708
								0,393	16,77	0,699
Lys	8,07	5,21	2,93	1,35	5,18	18	0,035	2,568	18	0,019
								2,946	16,48	0,009

Примечание. X _i - среднее группы 1, X ₂ — среднее группы 2, s 1 - стандартное отклонение группы 1, s₂ — стандартное отклонение группы 2, F – значение критерия Левена, t – значение критерия Стьюдента, df – число степеней свободы, p – достигнутый уровень значимости. В первой строке для каждой из перечисленных аминокислот представлены результаты расчёта критерия Стьюдента (t, df, p), вычисленные при условии принятия гипотезы о равенстве дисперсий. Во второй строке - результаты расчёта критерия Стьюдента (t, df, p), вычисленные при условии отклонения гипотезы о равенстве дисперсий. Жирным шрифтом выделены значения, которые нужно использовать для интерпретации результатов.

Note. X _i - group average 1, X ₂ - group average 2, s 1 - standard deviation of group 1, s₂ - standard deviation of group 2, F – value of Levene's test, t – value of Student’s test, df – number of degrees of freedom, p – achieved level of significance. The first line for each of these amino acids presents the results of the Student's test calculation (t, df, p), calculated under the assumption of the hypothesis of equality of variances. The second line presents the results of the Student's test calculation (t, df, p), calculated under the condition of nonacceptance of the hypothesis of equality of variances. Bold indicates the values to be used to interpret the results.

Для оценки деревьев классификации и их способности к прогнозированию использовалась гло-

Рис. 1. Граф дерева классификации образцов мочевых камней по составу 14 аминокислот (тип ветвления - полный перебор для одномерных ветвлений по методу C&RT, условие остановки - прямая остановка, априорные вероятности – 0,67 оксалатные, 0,22 фосфатные, 0,11 уратные).

Fig. 1. Graph of classification tree of uroliths samples by composition of 14 amino acids (split selection method – C&RT-style exhaustive search for univariate splits, stopping rule - FACT-style direct stopping, a priori probabilities – 0,67 oxalate, 0,22 phosphate, 0,11 urate).

Рис. 2. Граф дерева классификации образцов мочевых камней по составу 14 аминокислот (тип ветвления - дискриминантное ветвление по линейным комбинациям порядковых предикторов (содержаний всех 14 аминокислот), условие остановки - прямая остановка, априорные вероятности – 0,67 оксалатные, 0,22 фосфатные, 0,11 уратные).

Fig. 2. G raph of classification tree of uroliths samples by composition of 14 amino acids (split selection method – discriminant-based linear combination split for ordinal predictors (contents of all 14 amino acids), stopping rule - FACT-style direct stopping, a priori probabilities – 0,67 oxalate, 0,22 phosphate, 0,11 urate).

бальная кросс-проверка [18]. Для полученных трёх деревьев классификации, дающих 100%-ную верную классификацию для 28 образцов уролитов, глобальная кросспроверка показала наличие ошибок классификации. Наилучший результат (наименьшее число ошибок классификации, наименьшая цена кросс-проверки) получен для дерева классификации, построенного по линейным комбинациям предикторов (содержаний аминокислот), цена глобальной кросс-проверки составила 0,185 (средняя доля ошибочно классифицированных образцов – 18,5%). Полученное дерево классификации (рис. 2) имеет два ветвления и три терминальные вершины. Первое ветвление по линейной комбинации в корневой вершине отделяет оксалатные от двух других типов и относит их к терминальной вершине 3. Остальные образцы (уратные и фосфатные) отнесены к вершине 2 (решающей вершине). Второе ветвление (уже по другой линейной комбинации) отделяет уратные от фосфатных. Дерево классификации правильно классифицировало все образцы: каждая из терминальных вершин не содержит неправильно классифицированных образцов.

Для сравнения был применен линейный дискриминантный анализ. Результаты, полученные методом деревья классификации с типом ветвления по линейным комбинациям порядковых предикторов и дискриминантным анализом, схожи. С помощью дискриминантного анализа установлено, что все три типа уролитов различаются по АК составу статистически значимо (статистика Лямбда Уилкса 0,005 при уровне значимости p = 1,37Е-09). Для выявления информативных аминокислот, вносящих наиболее значимый вклад в различение образцов мочевых камней разных типов, был проведен дискриминантный анализ двумя методами: пошаговый с включением, пошаговый с исключением [19]. Методом пошаговый с включением была получена 100%-ная правильная классификация образцов уролитов и выявлены десять наиболее информативных аминокислот – Gly, Tyr, Lys, Leu, Ile, Ser, Thr, Phe, Glu, Pro. По их содержанию совокупности образцов уролитов разных типов различаются статистически значимо (статистика лямбда Уилкса 0,008 при уровне значимости p = 1,8Е-12). Апостериорные вероятности принадлежности мочевых камней к своему типу (с априорными вероятностями, взятыми согласно исходным частотам встречаемости образцов) высоки – от 0,9996 до 1,0. Заметим, что три (Gly, Lys, Glu) из десяти информативных аминокислот - это аминокислоты, которые статистически значимо (p<0,017) различают пары типов уролитов, согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни и параметрическому непарному критерию Стьюдента. Также следует отметить, что семь (Tyr, Lys, Leu, Ile, Ser, Phe, Glu) из этих десяти информативных аминокислот имеют распределения, близкие к нормальному для некоторых типов уролитов. По этим 10 информативным аминокислотам были вычислены две канонические дискриминантные функции (число типов минус один). Первая дискриминантная функция заключает в себе 71,7 % общих дискриминантных возможностей и очень хорошо различает оксалатные от двух других типов мочевых камней, но плохо различает уратные и фосфатные. Наибольший вклад в значение первой дискриминантной функции вносят Gly, Leu, Ile, Ser, Thr. Вторая дискриминантная функция заключает в себе 28,3 % дискриминантных возможностей и очень хорошо различает фосфатные и уратные образцы. Наибольший вклад в значение второй дискриминантной функции вносят Tyr и Phe. На рис. 3 видно, что все три типа уро-

О уратные

□ фосфатные д оксалатные

Рис. 3. Расположение образцов уролитов на плоскости, заданной первой и второй дискриминантными функциями (вычисленными по 10 информативным аминокислотам, полученным методом пошаговый с включением).

Fig. 3. Location of uroliths samples on the plane defined by the first and second discriminant functions (calculated from 10 informative amino acids by the stepwise with inclusion method).

литов четко разделяются. Исходя из значений статистических характеристик (см. таблицы 3, 4) в совокупности обе дискриминантные функции статистически значимо различают изученные три типа образцов.

Отметим, что оба метода разделили все образцы верно, используя только две линейные функции, причем первая функция для обоих методов отделяет оксалатные от двух других типов уролитов, а вторая разделяет фосфатные и уратные. Эти методы, хотя и дают схожие результаты, но не являются функционально эквивалентными.

Таблица 3 Показатели значимости дискриминантных функций (ДФ)

Table 3

Indicators of significance of discriminant functions (DF)

ДФ	Собственное значение	Относительное процентное содержание	Каноническая корреляция
1	16,107	71,7	0,97
2	6,359	28,3	0,93

Таблица 4

Результаты проверки статистической значимости остаточной дискриминантной способности системы

Table 4

Results of verification of statistical significance of residual discriminant capacity of the system

k	Лямбда Уилкса	Хи-квадрат	Степени свободы	p-уровень
0	0,008	99,127	20	1,80E-12
1	0,136	40,918	9	5,18E-06

Примечание. k – количество последовательно исключённых дискриминантных функций, начиная с первой.

Note. k – number of subsequently excluded discriminant functions, starting with the first.

Заключение

Проведенный статистический анализ позволил выявить отличия в аминокислотном составе трех изученных типов уролитов жителей Республики Коми. Установлены индивидуальные аминокислоты, по которым различные типы мочевых камней различаются статистически значимо. С помощью критерия Манна-Уитни выявлено, что уратные уролиты (мочевая кислота) по относительному содержанию глицина и глутаминовой кислоты статистически значимо отличаются от оксалатных (уэвел-лит, уэдделлит) и фосфатных (струвит, апатит), а фосфатные отличаются от мочекислых по содержанию аспарагиновой кислоты. С помощью критерия Стьюдента установлено, что фосфатные и оксалатные конкременты статистически значимо отличаются по относительному содержанию лизина. Одномерными статистическими методами показано, что ни одна аминокислота не различает попарно все три типа мочевых камней.

Многомерные методы (деревья классификации, дискриминантный анализ) показали наличие взаимосвязи между минеральной составляющей уролитов и составом входящих в них аминокислот. Полученные две линейные функции для обоих методов классификации (деревья классификации, дискриминантный анализ) четко различают все три типа уролитов.

Таким образом, проведенный статистический анализ показал существование взаимосвязи аминокислотного состава уролитов с их минеральной фазой. Это, в свою очередь, позволяет уверенно говорить о ведущей роли белковых веществ в процессе формирования уролитов в организме человека и их непосредственном влиянии на состав минеральных компонентов.