Стереологический анализ передней большеберцовой мышцы и капилляров эндомизия в эксперименте с дозированным удлинением голени при четырехкратной и автоматической дробности

Выбору оптимального режима дистракции при дистракционном остеосинтезе конечностей посвящены работы, касающиеся морфологии периферических нервов, магистральных сосудов, костного регенерата. В наших предыдущих работах по количественному стереологическому анализу уже анализировались особенности адаптационных процессов передней большеберцовой мышцы при различных режимах дистрак- ции [5, 6]. Эти исследования касались тканевого уровня организации мышцы, и анализировалась только опытная конечность. Ультраструктура микрососудистого эндотелия удлиняемой голени в различных условиях дистракции, вероятно, должна иметь адаптационные особенности. Сравнительный анализ ультраструктур капилляров эндомизия возможен лишь при использовании стереологического метода, так как визу- альные различия в данном случае беспредметны. Целесообразность применения метода стереологии ярко продемонстрирована в литературе на примере количественного анализа ультраструктур мышечных волокон и кровеносных капилляров на четырех стадиях облитерирующего эндартериита человека [1]. Роль эндотелия макро- и микрососудов многогранна, основные функции – гемато-тканевой обмен, регуляция гомеостаза [4, 7, 8, 9, 10].

Цель работы – сравнительный анализ стереометрических характеристик передней большеберцовой мышцы и капилляров эндомизия опытной и контралатеральной конечностей в эксперименте с различной дробностью дистракции голени.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах на взрослых беспородных собаках производили дозированное удлинение голени с темпом 1 мм в сутки: в четырехкратном режиме - 0,25 x 4 (I серия) и с использованием автодистрактора 0,017х60 (II серия), вели клинические наблюдения за функцией удлиняемой конечности и состоянием животных на протяжении всего экспериментального периода. Животных выводили из опыта через 14 и 28 дней дистракции, 30 дней фиксации, 30 и 180 дней после снятия аппарата. Методом стереоло-гического анализа исследовали передние большеберцовые мышцы опытной и контралатеральной конечностей первой серии (n=10) и второй серии (n=11). Исследовано 3 интактных животных – интактная серия. Материал для гистохимического исследования забирали из средней трети брюшка передней большеберцовой мышцы, из нефиксированного материала изготавливали криостатные срезы, выявляли активность миозиновой АТФ-азы. С помощью тестовой решетки коротких отрезков методом сте-реологического анализа определяли: объемную (Vv), поверхностную (S V ), численную (N А ) плотность микрососудов, мышечных волокон и объемную плотность соединительной ткани. Также рассчитывали вторичные параметры: отношение численной плотности микрососудов к численной плотности мышечных волокон (Na_МС/NA_МВ) – параметр, отражающий васкуляризацию мышцы и косвенно степень ее оксигенации [5], отношение поверхностной плотности

РЕЗУЛЬТАТЫ

На поперечных срезах мышц с выявленной активностью миозиновой АТФ-азы идентифицируются мышечные волокна двух основных типов, интенсивность реакции несколько выше в контралатеральной конечности, чем в оперированной. Визуально гистологические картины мышцы в двух сериях различаются: через 14 дней автодистракции – более многочисленные и меньшего диаметра как микрососуды, так и мышечные волокна. При четырехкратном режиме отмечаются мышечные волокна большего диаметра и часто продольно ориентированные микрососудов к поверхностной плотности мышечных волокон (SVМС/SVМВ) – площадь гемато-тканевой диффузии [5]. Для выборок с нормальным распределением определяли достоверность различий между экспериментальными сериями по t-критерию Стьюдента. Дополнительно произведен ультраструктурно-стереологический анализ эндотелия капилляров передней большеберцовой мышцы через 28 дней дистракции и месяц фиксации (8 собак из числа вышеуказанных). Для получения ультра-тонких срезов из средней трети брюшка передней большеберцовой мышцы иссекали небольшой участок, закрепляли на жесткой основе, после альдегидно-осмиевой фиксации, дегидратации в спиртах и ацетоне полимеризовали в эпоксидных смолах. Ультратонкие срезы исследовали в трансмиссионном микроскопе JЕМ-100В при увеличении 11800х. Используя открытую тестовую решетку коротких отрезков, в безъядерных зонах эндотелия определяли: долю площади, занимаемую следами цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) и митохондрий (МТХ) в площади следа эндотелия (Э) (АГЭР/АЭ); протяженность зон межклеточных контактов (МК) в тестовой площади следа эндотелия (ТМК/АЭ) [1]. Достоверность различий выборок для опытной и контралатеральной конечностей, для опытной конечности между сериями эксперимента определяли по W-критерию Вилкоксона для независимых выборок.

ИССЛЕДОВАНИЯ микрососуды на поперечных срезах мышцы (рис. 1). Через 28 дней в автоматическом режиме дистракции несколько меньшие диаметры мышечных волокон сохраняются.

По результатам стереологического анализа передней большеберцовой мышцы в опытной конечности численная плотность микрососудов через 14 и 28 дней автодистракции составила 220 и 200% от значения интактной серии (Р < 0,001), соответственно при четырехкратном режиме - лишь 140 и 120% (Р < 0,001) (рис. 2).

опытная конечность

контралатеральная конечность интактная серия

опытная конечность

контралатеральная конечность

Рис. 1. Передняя большеберцовая мышца: а, б, в - через 14; д, е, ж, з – через 28 дней дистракционного остеосинтеза голени в различных условиях эксперимента; г – интактная серия. Слева – первая серия (0,25 х 4), справа – вторая серия (0,017 х 60). Поперечные криостатные срезы с выявленной активностью миозиновой АТФ-азы по Padicula, German. МВ – мышечные волокна, МС – микрососуды, СТ – соединительная ткань. Об. 16, ок. 10х

Рис. 2. Численная плотность микрососудов (N А _МC) в передней большеберцовой мышце при дистракционном остеосинтезе голени в динамике эксперимента

ческом удлинении, оставаясь на уровне интактной серии в условиях четырехкратной дробности (рис. 4). Через 28 дней дистракции значение N А_МС /N А_МВ в обоих режимах составляет 150% от значения интактной серии. Через месяц фиксации этот параметр во II серии снижается в 3,3, а в I – лишь в 1,9 раза. В первом случае данный факт обусловлен снижением численной плотности микрососудов при повышении численной плотности мышечных волокон, а во втором – снижение происходит на фоне увеличения численной плотности и мышечных волокон, и микрососудов. В период после снятия аппарата значение N А _МС / N А _МВ ниже контрольного уровня в обеих сериях.

Разница в численной плотности микрососудов между режимами в исследуемые сроки составила 1,5 и 1,7 раза (Р < 0,001). Через месяц фиксации в серии с четырехкратным режимом N А микрососудов на оперированной голени несколько увеличивается, при автодистракции – снижается в 1,9 раза (Р < 0,001). Через месяц после снятия аппарата в I серии численная плотность микрососудов уменьшается в 1,4 раза относительно предыдущего срока (Р < 0,001), во II – возрастает в 1,3 раза (Р < 0,001). Через полгода после снятия аппарата данный параметр выше в 1,2 раза (Р < 0,001) в I серии эксперимента по сравнению со второй серией.

Динамика численной плотности мышечных волокон в эксперименте с четырехкратным режимом дистракции аналогична таковой для микрососудов в этой серии (рис. 3). При автоматическом удлинении иначе: через 14 дней удлинения N А мышечных волокон, аналогично микрососудам, значительно возрастает, составляя 290% от значения интактной серии (Р < 0,001), а к 28 дню – снижается в 2,2 раза относительно предыдущего срока, в то время как число микрососудов уменьшается незначительно. Через месяц фиксации численная плотность мышечных волокон возрастает в 1,7 раза при снижении численной плотности микрососудов. Через месяц после снятия аппарата N А мышечных волокон снижается в 1,6 раза (Р < 0,001) при увеличении N А микрососудов.

Различия между режимами в соотношении численной плотности микрососудов и мышечных волокон обусловливают степень васкуляризации мышцы. Через 14 дней дистракции значение данного параметра несколько меньше при автомати-

Рис. 3. Численная плотность мышечных волокон (N A МВ ) в передней большеберцовой мышце при дистракционном остеосинтезе голени в динамике эксперимен-та Площадь гемато-тканевой диффузии через

14 дней удлинения голени выше при четырехкратном режиме в 1,6 раза, через 28 дней дистракции значение данного параметра идентично в сравниваемых сериях (рис. 5). Через месяц фиксации S V_МС /S V_МВ выше в 1,7 раза в I серии эксперимента, а через месяц после снятия аппарата в 2,2 раза выше во II серии. Через 180 дней после снятия аппарата значение S V_МС /S V_МВ одинаково в сравниваемых сериях, составляя 75% от значения интактной серии. Площадь гемато-тканевой диффузии обусловлена в большей степени поверхностной плотностью микрососудов (рис. 6).

Объемная плотность сосудистого русла при сравнении серий эксперимента достоверно выше лишь через 28 дней автодистракции (Р < 0,05) (рис. 7).

Рис. 4. Параметр, оценивающий васкуляризацию передней большеберцовой мышцы (N A _МС/N A _МВ) в динамике эксперимента с дистракционным остеосинтезом голени

Рис. 5. Площадь гемато-тканевой диффузии (S V _МС/S V _МВ) в передней большеберцовой мышце при дистракционном остеосинтезе голени в динамике эксперимента

Рис. 6. Поверхностная плотность микрососудов (S V МС ) в передней большеберцовой мышце при дистракционном остеосинтезе голени в динамике эксперимента

VvMC

0,25х4

Vv

■♦ Опытн. —    - Контралатер.

Инт.      Д14      Д28      Ф30     БА30    БА180

Опытн. — -е- - Контралатер.

Инт.      Д14      Д28      Ф30     БА30    БА180

Рис. 7. Относительный объем микрососудов (VV  ) в передней большеберцовой мышце при дистракционном остеосинтезе голени

в

динамике

эксперимента

Во все другие сроки эксперимента существенные различия отсутствуют. Через 30 дней фиксации при одинаковом относительном объеме сосудов отмечена большая (в 1,6 раза) (Р < 0,001) относительная площадь их поверхности в первой серии, что может свидетельствовать о микрососудах большего калибра и мелких сосудах при автодистракции. Через месяц без аппарата обратное соотношение: при одинаковом значении объемной плотности микрососудов их поверхностная плотность в 1,7 раза (Р < 0,001) выше в серии с автодистракцией, что обусловлено в большей степени снижением поверхностной плотности мышечных волокон относительно предыдущего срока эксперимента и, соответственно, увеличением их диаметра.

Для дополнения стереометрических данных мышц удлиняемой голени в различных режимах дистракции исследовали капилляры эндомизия передней большеберцовой мышцы при четырехкратной и автоматической дробности дистракции, наиболее используемых в медицинской практике. В базальном слое капилляров соматического типа локализованы 1-3 перицита с цитоплазматическими отростками. Люминальная поверхность эндотелиальных клеток часто образует цитоплазматические выросты, выпячивания внутрь просвета, чаще – в зоне межклеточных контактов. Система микровезикул выражена достаточно хорошо, визуальные различия между режимами почти отсутствуют (рис. 8). Гранулярная эндоплазматическая сеть в виде узких цистерн, мелкие митохондрии немногочисленны.

В конце дистракции доля площади, занимаемая следами цистерн ГЭР в площади всего эндотелия, в I серии в 1,3 раза выше, чем во II-й (Р < 0,01) (рис. 9). Через месяц фиксации значение данного параметра при автодистракции снижается недостоверно, при 4-кратном режиме – возрастает в 1,7 раза (Р < 0,01), что в 3,3 раза больше (Р < 0,01), чем во II серии.

Доля площади, занимаемая следами митохондрий в площади всего эндотелия, через месяц удлинения в I серии больше в 2,6 раза (Р < 0,001), чем во II-й, через месяц фиксации значение этого параметра при четырехкратном режиме снижается в 2,0 раза (Р < 0,01) относительно предыдущего срока, при автодистракции – не изменяется (рис. 10).

Протяженность зон межклеточных контактов в тестовой площади следа эндотелия через месяц автодистракции в 2,0 раза (Р < 0,01) и через месяц фиксации в 1,6 раза ниже (недостоверно), чем при четырехкратном режиме (рис. 11). Через 30 дней фиксации значение данного параметра в I серии снижается в 1,8 раза (Р < 0,001) относительно предыдущего срока, во II-й – изменения не достоверны.

а)

б)

Рис. 8. Капилляры эндомизия передней большеберцовой мышцы через месяц дистракции: а) с 60-кратной, б) с 4-кратной дробностью. Э – эндотелио-цит, Пк – просвет капилляра, Эр – эритроцит, Пц – перицит, МК – межклеточный контакт, Мв – микро-пиноцитозные везикулы. Электронограммы, инструментальное увеличение 11800х

Рис. 9. Доля площади, занимаемая следами цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума в площади следа эндотелия (А ГЭР /А Э )

...         ■ Опытная конечность

Амтх/Аэ, %

3 5                 ■ Контралатеральная конечность

0.25x4

Дистракция 28 дней               Фиксация 30 дней

Срок эксперимента

Рис. 10. Доля площади, занимаемая следами митохондрий в площади следа эндотелия (А МТХ /А Э )

Рис. 11. Протяженность зон межклеточных контактов в тестовой площади следа эндотелия (Т МК /А Э )

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Состояние микрососудов при дистракции является важным фактором. Исследованиями эндотелия макро- и микрососудов в регуляции гомеостаза установлено его полифункциональное значение. Как главный компонент гисто-гематических барьеров эндотелий осуществляет обмен между кровью и тканями [7, 9], биосинтез разнообразных факторов, участвующих в регуляции фенотипа гладкомышечных клеток [4, 8], в процессах гемокоагуляции [10]. Тот факт, что через 28 дней удлинения в режиме четырехкратной дробности А МТХ /А Э и Т МК /А Э значительно выше, А _ГЭР /А _Э так же достоверно выше, чем при автодистракции, согласуется с тем, что на тканевом уровне при меньшем в 1,5 раза числе микрососудов площадь гемато-тканевой диффузии выше в I cерии в 1,6 раза. Вероятно, потребность в адгезии эндотелиальных клеток при четырехкратном режиме удлинения гораздо выше, чем при автодистракции, а большая потребность в усиленном энергообеспечении отражена в 2,6 раза большим значением параметра А МТХ /А Э . Через 30 дней фиксации последний параметр незначительно, А ГЭР /А Э и Т МК /А Э существенно больше при четырехкратном режиме также подтверждается стереологией на тканевом уровне: площадь поверхности микрососудов более чем в 2 раза выше при четырехкратном режиме при резком снижении поверхностной плотности микрососудов после автоматической дистракции.

Таким образом, анализ стереологических характеристик передней большеберцовой мышцы и клинические наблюдения за функциональным состоянием удлиняемой конечности в сравниваемых сериях эксперимента характеризуют различные течения адаптационных процессов в мышце в зависимости от дробности дистракции. При автоматическом удлинении голени клиническая картина значительно лучше, чем при 4-кратной дробности дистракции. Это объясняется лучшим кровоснабжением мышечной ткани при высокодробной дистракции, о котором свидетельствуют такие показатели, как численная плотность микрососудов и параметр, отражающий степень васкуляризации мышцы (NaМС/NAМВ). При четырехкратной дробности удлинения голени меньшее значение численной плотности микрососудов и параметра, отражающего васкуляризацию мышцы, скомпенсированы большей площадью гемато-тканевой диффузии. На ультраструктурном уровне получены результаты, подтверждающие различные проявлениях адаптации сосудистого эндотелия к дозированному растяжению в различных условиях. Большая протяженность зон межклеточных контактов в площади следа эндотелия при дистракции голени с четырехкратной дробностью может свидетельствовать о повышении адгезивных свойств эндотелиоцитов [3]. Доли площадей, занимаемые следами цистерн ГЭР и МТХ, в площади следа эндотелия при 4-кратном режиме удлинения характеризуют высокую метаболическую активность и интенсификацию окислительновосстановительных процессов эндотелиоцитов по сравнению с автодистракцией.