Стерины и полифенолы фукоидов мурманского побережья Баренцева моря

Фукусовые водоросли являются природными источниками биологически активных веществ (БАВ): полисахаридов, липидов, пигментов, стеринов, полифенолов и др. Качественные и количественные характеристики этих БАВ водорослей изменяются в зависимости от многих факторов, таких как вид водорослей (видоспецифичность), стадии развития растений, условия их произрастания и т. д. Представители рода Fucus – перспективные источники получения экстрактов, обогащенных полифенолами – растительными антиоксидантами, а также фитостеринов, обладающих широким спектром биологической активности. Данные соединения, выделенные из морских водорослей, используются в качестве ценного ресурса при изготовлении новых растительных лекарственных препаратов, которые ранее создавались на основе только высших наземных растений.

Полифенольные соединения фукоидов, как и других фукусовых водорослей, главным образом состоят из флоротаннинов – продуктов полимеризации флороглюцина (1,3,5-тригидроксибензола) (рис. 1, б) [1]. Почти все фенольные соединения являются активными метаболитами клеточного обмена и играют существенную роль в различных физиологических процессах (дыхании, фотосинтезе, росте, развитии и репродукции) [2]; флоротаннины участвуют в построении клеточных стенок, синтезируются в ответ на повреждения, а также экранируют солнечное УФ-излучение [3].

а                                  б

Рис. 1. Структурные формулы фукостерола (а) и флороглюцина (б)

Fig. 1. The structural formula of fucosterol (a) and phloroglucinol (б)

Стерины (стеролы) – органические спирты, относящиеся к группе стероидов, составная часть неомыляемой фракции животных и растительных липидов. Наиболее распространенным стерином бурых водорослей является фукостерин, который содержится только в мембранах водорослей и отсутствует у высших растений [4].

Предположительно, и стерины и полифенолы участвуют в процессе адаптации растений к стрессовым условиям. Имеются данные, что растения, выращенные в условиях пониженной температуры, короткого дня или высокой засоленности почв, характеризуются измененным соотношением стеринов и фосфолипидов в мембранах, а также полифенолов. Кроме того, изменения в стериновом составе приводят к нарушениям активного и пассивного транспорта через мембраны, снижают активность мембранных ферментов [5]. Содержание фитостеринов и полифенолов водорослей Баренцева моря остается малоизученным.

Цель данной работы – изучение содержания фитостеринов и полифенолов в фукусовых водорослях, собранных в разных биотопах мурманского побережья Баренцева моря.

Материалы и методы

Объектом исследования послужили водоросли Fucus vesiculosus, F. serratus, F. distichus, Ascopyllum nodosum как наиболее распространенные представители фукоидов в Баренцевом море.

Водоросли для исследования содержания общих фенолов были собраны в 2012–2014 гг. в течение четырех гидрологических сезонов (зима, весна, лето, осень) в экспедициях ФГБУН ММБИ КНЦ РАН на станциях в губах и заливах Кольского полуострова. Для сравнения были выбраны акватории Западного, Восточного и Центрального Мурмана (рис. 2), в разной степени подверженные антропогенному влиянию [6]. В каждой акватории станции были выбраны на основании данных литературы и собственных измерений таким образом, чтобы соленость воды имела максимальное и минимальное значения (табл. 1).

Рис. 2. Район исследований

Fig. 2. The study area

Сбор водорослей для определения стеринов и полифенолов производился в июле, сентябре, а также в период с октября по декабрь 2016 г. в различных по абиотическим факторам и антропогенному влиянию биотопах мурманского побережья Баренцева моря [6]: бухте Белокаменная, губе Ярнышная (рис. 2).

Для исследования были собраны растения в возрасте 4+…7+ лет. Образцы водорослей были заморожены и хранились при температуре –30 ºС.

Полифенолы и стерины извлекали из замороженных измельченных слоевищ водорослей методом перколяции. В качестве экстрагента использовали 96%-й раствор этилового спирта. Экстракцию этанолом проводили при комнатной температуре.

Содержание общих полифенолов определяли по модифицированной методике с использованием реактива Фолина – Чокальтеу [1] в пересчете на флороглюцин (Merck, номер в каталоге № 203-611-2).

Для количественного определения фитостеринов использовали реакцию с раствором серной кислоты (72%-й раствор H 2 SO 4 ) и 8%-м раствором ванилина [7]. Содержание стеринов определяли относительно стандартов фукостерина (Sigma, номер в каталоге № F5379), стигмастерина (Fluka, номер в каталоге № 85860), эргокальциферола (Fluka, номер в каталоге № 95220). Подобраны условия проведения реакции и концентрации реагентов для исследуемых водорослей. Измерения проводили методом спектрофотометрии.

Абсолютно сухую массу образцов определяли согласно общепринятой методике (ГОСТ 26185-84. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки. Методы анализа).

Определение содержания липофильных веществ проводили согласно общей фармакопейной статье (Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. ОФС.1.5.3.0006.15). В качестве растворителя использовали 96%-й этанол. Маннит из экстракта был удален.

Таблица 1. Характеристика районов сбора и среднее содержание общих фенолов в фукусовых водорослях Мурмана 2012–2014 гг.

Table 1. Characteristics of collection areas and the average content of total phenols in fucus algae of Murman, 2012–2014

Район сбора проб	CL S Я H	Место сбора проб	H о 2 о ч о и	и ® с к В 1 5 &S	Концентрации общих фенолов, % а.с.м. (n = 15)
					F. vesiculosus	F. distichus	F. serratus	A. nodosum
Кольский залив	1	Абрам-мыс	19–25	6.6	2.24 ± 0.02	2.03 ± 0.09	–	1.59 ± 0.08
	2	Бухта Белокаменная	29–33	4.6	5.34 ± 0.50	5.36 ± 0.25	4.98 ± 0.10	2.24 ± 0.11
Губа Печенга	3	Кут губы Печенга	21–25	8.4	3.47 ± 0.07	–	–	–
	4	Бухта Девкина Заводь	30–34	6.0	5.41 ± 0.38	3.00 ± 0.17	7.63 ± 0.41	3.33 ± 0.56
Губа Териберская	5	Губа Корабельная	21–25	4.2	4.01 ± 0.13	5.29 ± 0.26	6.55 ± 0.30	1.91 ± 0.05
	6	Губа Лодейная	25–30	9.0	8.63 ± 0.88	9.62 ± 1.12	7.76 ± 0.72	7.06 ± 1.01
Губа Ярнышная	7а	Бухта Бобровая	12–15	3.0	5.85 ± 0.43	3.01 ± 0.29	3.19 ± 0.17	1.57 ± 0.09
	8а	Центральная часть губы Ярнышная	32–34	1.9	4.07 ± 0.19	3.85 ± 0.24	4.46 ± 0.12	3.36 ± 0.46
Губа Зеленецкая	7б	Губа Оскара	25–30	2.8	5.42 ± 0.34	5.16 ± 0.19	7.28 ± 0.42	4.76 ± 0.37
	8б	Бухта Прибойная	33–34	2.0	2.52 ± 0.03	1.31 ± 0.10	3.19 ± 0.22	1.76 ± 0.04

Примечание: а.с.м. – абсолютно сухая масса.

Определение содержания полифенолов и фитостеринов проводили в трехкратной повторности.

Полученные данные были обработаны с использованием программы Microsoft Excel, включающей математические и статистические формулы.

Трехфакторный дисперсионный анализ (MANOVA) был использован для изучения влияния факторов сезонности, места обитания, солености (и их взаимодействий) на содержание общих полифенолов фукусовых водорослей Мурмана; в процессе анализа применяли программу NCSS Statistical and Data Analysis v2005.

Результаты и обсуждение

Исследование содержания общих фенолов в акватории Западного, Восточного и Центрального Мурмана в 2012–2014 гг.

Полученные результаты исследования среднего содержания общих полифенолов в фукоидах акваторий мурманского побережья Баренцева моря заметно различаются (табл. 1). Во всех фукусовых водорослях обнаружены максимальные концентрации полифенолов (7,06–9,62 %) в губе Лодейная, которая характеризуется наибольшим уровнем загрязнения тяжелыми металлами по сравнению с указанными районами [6], что подтверждается и другими исследованиями. Так, в работе Å. Forsberg et al. есть данные о том, что большие количества тяжелых металлов способствуют накоплению полифенолов в F. vesiculosus Балтийского моря [8]. При сравнении фукоидов Мурмана по содержанию полифенолов установлено, что минимальные значения характерны для A. nodosum (1,5–3,3 %), а у представителей F. vesiculosus и F. serratus обнаружены более высокие концентрации (в среднем выше в 1,7–2,0 раза).

Известно, что основными факторами, влияющими на биохимический состав водорослей-макрофитов, являются температура, соленость, химический состав морской воды, интенсивность движения воды, длина светового дня и другие абиотические факторы [9]. Макроводоросли отличаются от высших растений по многим показателям, в частности формированием и функционированием клеточных органоидов. Являясь водными организмами, водоросли постоянно контактируют с водной средой, реагируя на изменение внешних условий на биохимическом уровне. Фитохимический состав макроводорослей характеризуется видоспецифичностью и меняется в зависимости от местообитания (комплекса факторов), сезона сбора и т. п.

В работе K. Kyung-Tae (2012) [10] показано, что собранные в Канаде F.vesiculosus и A. nodosum содержат малое количество полифенолов в период с весны до раннего лета, после чего наблюдалось повышение уровня полифенолов вплоть до сентября. У A. nodosum в сентябре количество полифенолов было выше, чем в мае и июне, однако у F. vesiculosus наблюдалось увеличение количества полифенолов с августа и достигало максимальных значений в октябре – ноябре. Если сравнивать эти виды в июле, то в этот период A. nodosum содержит вдвое больше полифенолов, чем F. vesiculosus. Сентябрь и октябрь являются наиболее оптимальными месяцами для сбора канадских водорослей с целью выделения фенолов.

Согласно данным M. A. Ragan (1978) [11] по Норвежскому морю, высокие значения полифенолов у A. nodosum отмечены с октября по конец февраля. Минимальные количества этих соединений наблюдались с апреля по май, затем уровень начинал возрастать, достигая высоких зимних значений в августе – сентябре. У F. vesiculosus максимум наблюдался зимой, затем в марте начинался спад и минимум отмечался с мая по июнь. Затем высокие зимние значения вновь достигались в сентябре – октябре.

F. vesiculosus

-■- F. distichus

—*- F. serratus

A. nodosum октябрь февраль апрель июль

Рис. 3. Сезонные изменения содержания общих фенолов, % а.с.м., в фукусовых водорослях бухты Белокаменная в 2013–2014 гг. Fig. 3. Seasonal changes in the content of total phenols, % a.d.w. in fucus algae from the Belokamennaya Bay in 2013–2014

При исследовании сезонных изменений содержания полифенолов в четырех видах фукусовых водорослей (рис. 3) нами не выявлено единой тенденции. Водоросли F. vesiculosus и F. distichus накапливали полифенолы в весенний период, у F. serratus максимум полифенолов обнаружен в феврале, у A. nodosum – осенью. Эти данные касались водорослей, обитающих в районе бухты Белокаменная в 2013–2014 гг. Для других исследуемых акваторий сезонные изменения в накоплении полифенолов различны, невозможно выделить единой зависимости. Другими исследователями было показано, что для фукуса пузырчатого, обитающего в районе Абрам-мыса (Кольский залив), максимальное содержание полифенолов отмечается в весенний период, когда активизируются физиологические процессы [12]. В соответствии с результатами нашего исследования можно подтвердить данную закономерность для вида F. vesiculosus, обитающего в Кольском заливе.

Важным фактором, который выделяют исследователи биохимического состава водорослей, является соленость морской воды. Растения, обитающие в условиях пониженной солености, обладают меньшей "восстановительной способностью", чем те, что растут в условиях нормальной солености (около 35 ‰). Однако I. Munda (1960) [13] показал, что пересадка A. nodosum и F. vesiculosus из Норвежского моря в районы с другой (низкой или высокой) соленостью в большинстве случаев не имела эффекта. Вымыванию полифенолов способствовало распреснение [14] и умеренное [11] или интенсивное [14] освещение, а также увеличение солености [15]. В литературе не найдено фактов очевидной корреляции между соленостью, освещенностью и содержанием фенолов. Так, содержание полифенолов в A. nodosum неуклонно снижалось после февраля, в то время как количество солнечного света увеличивалось с марта по май. Однако уровень содержания полифенолов возрастал после этого периода несмотря на достаточное освещение с июля по август. Аналогичное уменьшение количества полифенолов наблюдалось задолго до каких-либо значительных изменений солености, температуры воды, уровня нитратов, и это количество увеличивалось вновь, хотя соленость была все еще низкой, температура воды была далека от максимальной и количество нитратов было минимальным [11].

Для выявления характера изменений содержания общих полифенолов в фукусовых водорослях Мурмана был проведен 3-факторный дисперсионный анализ MANOVA (табл. 2), который показал, что наибольшее влияние оказала соленость (11,25 %). Меньшее, но все же достоверное влияние имел фактор местообитания водорослей (6,09 %), включающий комплекс индивидуальных абиотических характеристик конкретной локации. Фактор сезонности оказался незначительным в нашем исследовании. Наибольшее влияние на содержание общих фенолов водорослей Мурмана оказало совместное взаимодействие факторов местообитания, солености, сезонности – 38,75 %. По критерию Фишера, статистическая модель достоверна (р < 0,05).

Таблица 2. Результаты 3-факторного дисперсионного анализа содержания общих полифенолов на примере F. vesiculosus Table 2. Results of three-way multivariate analyses of variance (MANOVA) in the content of total polyphenols, for example, F. vesiculosus

Фактор	df	F-test	FstР(<0,05)	η 2 , %
Местообитание	2	1330,89	3,26	6,09
Соленость	1	4917,34	4,11	11,25
Сезон	2	190,48	3,26	0,87
Местообитание + соленость	2	636,94	3,26	2,92
Местообитание + сезон	4	3216,80	2,63	29,44
Соленость + сезон	2	2314,10	3,26	10,60
Местообитание + соленость + сезон	4	4234,63	2,63	38,75

Исследование содержания фитостеринов и полифенолов в биотопах мурманского побережья Баренцева моря в 2016 г.

Результаты исследований, полученные в 2016 г., подтверждают тот факт, что F. vesiculosus является одним из наиболее богатых по количественному составу БАВ видом бурых водорослей Баренцева моря [16]. В них содержится наибольшее количество экстрактивных веществ липофильной природы, а также фитостеринов и полифенолов в сравнении с другими изученными видами (F. distichus, Ascopyllum nodosum). Причем данная закономерность справедлива для обеих исследованных локаций (бухты Белокаменная и губы Ярнышная), где были собраны разные виды бурых водорослей. Так, A. nodosum, содержащий наименьшее количество экстрактивных веществ, уступает фукусу пузырчатому по количеству фукостерина в среднем в 5,4 раза, полифенолов – в 4,3 раза, F. serratus и F. distichus – в 1,7–2,0 раза по содержанию как фукостерина, так и полифенолов (рис. 4, 5).

60,0

40,0

20,0

0,0

■ б. Белокаменная ■ г. Ярнышная

Рис. 4. Содержание фукостерина, мг/г

Fig. 4. The fucosterol content, mg/g

■ б. Белокаменная ■ г. Ярнышная

Рис. 5. Содержание суммы полифенолов, мг/г

Fig. 5. The content of total polyphenols, mg/g

Губа Ярнышная считается экологически чистым участком. Воды Кольского залива, особенно его южной части, характеризуются высоким уровнем загрязнения (начиная с 2004 г. оцениваются как грязные). Температурный режим районов сбора примерно одинаков в летне-осенний период [17].

Также установлено, что содержание фитостеринов и полифенолов в летне-осенний период выше в водорослях, собранных в губе Ярнышная, где сочетаются относительно мягкие климатические условия, хороший водообмен, узкий диапазон сезонной изменчивости среднемесячных и экстремальных значений температуры и солености воды [18]. Фитохимические показатели для водорослей данной местности по сравнению с обитающими в бухте Белокаменная выше в среднем в 1,8–3 раза. Важным фактором является степень антропогенной нагрузки в биотопах. Так, для губы Ярнышная она минимальна, а в бухте

Белокаменная отмечены нефтяные разливы, связанные с деятельностью пришвартованного вблизи залива рейдового перевалочного комплекса "Белокаменка". Выше в 2,4 раза и индекс загрязнения тяжелыми металлами по сравнению с губой Ярнышная. Учитывая тот факт, что в талломах водорослей, произрастающих в неблагоприятных условиях бухты Белокаменная, не накапливается большого количества стеринов и полифенолов, нельзя делать однозначные выводы об участии данных веществ в адаптации водорослей к окружающим условиям [3; 5].

В литературе есть данные о том, что фукостерин может накапливаться в мембранах клеток водорослей в период низких температур и низкого уровня освещения, что, возможно, является ответом на условия окружающей среды с целью сохранения целостности клеточных мембран [19]. Согласно литературным источникам температурный и световой факторы совместно влияют на количество фукостерола. По нашим ранее полученным результатам, наибольшее влияние на содержание полифенолов в фукоидах Баренцева моря оказывает соленостный режим вод биотопа, что нашло подтверждение и в данной работе.

В рамках настоящего исследования также было изучено содержание фукостерина и полифенольных соединений в F. vesiculosus Абрам-мыса в период с октября по декабрь 2016 г. Результаты, представленные на диаграмме (рис. 6), показали, что сумма экстрактивных веществ в талломе фукуса пузырчатого увеличивается к декабрю, а количество стеринов и полифенолов, наоборот, снижается. В декабре освещенность в течение дня была наименьшей в связи с наступлением периода полярной ночи; в этот месяц количество как фукостерина, так и полифенолов наименьшее. В октябре – ноябре количество полифенолов было выше в 1,4–1,5 раз, фукостерина – в 1,3–1,4 раза.

^^ Фукостерин

^^ Полифенолы

—*—Липофильные вещества

Рис. 6. Содержание фукостерина и суммы полифенолов в водорослях F. Vesiculosus Абрам-мыса, % от суммы липофильных веществ Fig. 6. The content of fucosterol and total polyphenols from F. vesiculosus from the cape Abram-Mys, % of the amount of lipophilic substances

Согласно литературным источникам в водоросли Sargassum horneri в октябре содержание фукостерола составляло 19,0 % от общих липидов, ноябре – 16,2, декабре – 14,7 %, максимальное количество данного соединения наблюдалось в мае (19,8 %), минимальное – в марте (10 %). Температура и длина светового дня снижались с октября по декабрь [19]. В другом исследовании, проводившемся с новозеландскими водорослями Undaria pinnatifida, установлено, что наибольшее количество неомыляемых липидов, а именно фукостерола и 24-метиленхолестерола, наблюдалось в зимний период, летом эти показатели значительно уменьшались [20]. В работе Honya et al. (1994) [21] говорится о том, что количество фукостерола и токоферола в бурой водоросли Laminaria japonica, обитающей в Японском море, достигает максимального значения зимой и быстро снижается осенью. Согласно данным S. S. Popov et al. (1985) [22] большое влияние на биосинтез, накопление и соотношение стеринов в водорослях Черного моря оказывает температура воды.

Сравнивая представленные в работе данные, полученные в 2016 г., можно сделать вывод о том, что количество фукостерина и полифенолов в водорослях F. vesiculosus, произрастающих в районе Абрам-мыса, в 5–13 раз меньшее, чем у тех, что произрастают в губе Ярнышная и бухте Белокаменная (рис. 7). При сопоставлении данных о содержании полифенолов в F. vesiculosus, собранных на Абрам-мысе, со средними значениями результатов, полученных в период 2012–2014 гг. (табл. 1), выявлено существенное снижение содержания этих веществ (с 2,2 до 0,4 %) в осенне-зимний период 2016 г., что, вероятно, связано с меняющимся в течение года физиологическим состоянием водорослей, абиотическими условиями, а также уровнем загрязнения в данном районе. Следует отметить, что проведенное исследование содержания фукостерина в фукусовых водорослях Мурмана является началом комплексного исследования БАВ и выводы носят предварительный характер.

■ г. Ярнышная

■ б. Белокаменная

■ м. Абрам-мыс

Рис. 7. Содержание фукостерина и суммы полифенолов в водорослях Fucus vesiculosus, собранных в разных районах, % от абсолютно сухой массы

Fig. 7. The content of fucosterol and total polyphenols in seaweeds Fucus vesiculosus from different areas, % a.d.w.

Заключение

В результате проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

• 1.    Обнаружены максимальные концентрации полифенолов (7,06–9,62 %) во всех фукусовых водорослях губы Лодейная, которая характеризуется наибольшим уровнем загрязнения тяжелыми металлами. При сравнении содержания полифенолов в фукоидах Мурмана установлено, что минимальные значения характерны для Ascophyllum nodosum (1,5–3,3 %), более высокие концентрации (в среднем выше в 1,7–2,0 раза) – для представителей Fucus vesiculosus и Fucus serratus.

• 2.    Характер изменений содержания общих полифенолов в фукусовых водорослях Мурмана, исследованный с использованием 3-факторного дисперсионного анализа MANOVA, свидетельствует о том, что степень влияния солености морской воды наиболее значима. Меньшее влияние оказывает фактор местообитания водорослей (комплекс индивидуальных абиотических характеристик конкретной локации). Фактор сезонности оказался статистически незначимым в отношении динамики накопления полифенолов в исследуемых фукоидах. Однако при детальном изучении выявлена сезонная зависимость содержания полифенолов: представители Fucus vesiculosus и Fucus distichus накапливали полифенолы в весенний период. Наибольшее влияние на содержание общих полифенолов в водорослях Мурмана отмечено при взаимодействии факторов местообитания, солености, сезонности (38,75 %).

• 3.    Водоросли Fucus vesiculosus являются наиболее богатыми по количеству фукостерина, полифенолов и экстрактивных веществ при сопоставлении их с другими массовыми представителями баренцевоморской флоры, такими как F. serratus, F. distichus и A. nodosum. Фукоиды, произрастающие в губе Ярнышная (восточное побережье Баренцева моря), содержат в два раза больше фукостерина и полифенолов, чем те, что обитают в бухте Белокаменная, и в 13 раз больше по сравнению с водорослями Абрам-мыса.

Работа выполнена в рамках Госзадания ММБИ КНЦ РАН на 2017 г. (базовое финансирование ФАНО) по теме "Научные основы инновационных технологий БАВ водорослей Баренцева моря", № в ГЗ 0228-2014-0015.