Стресспротективное действие сукцинатсодержащего препарата на лейкоцитарный состав крови крыс при воздействии гипоксии

Известно, что продолжительное воздействие дефицита кислорода на организм животных может стать причиной развития патологических процессов [10]. Гипоксия, как известно, сопровождается снижением энергетических и иных ресурсов в организме, а также уменьшением тканевого обмена веществ. Развитие гипоксии сопровождается каскадными реакциями со стороны жизненно важных систем органов, а причиной снижения компенсаторного резерва организма является дефицит энергетического запаса окислительного фосфорилирования в митохондриях, что непосредственно имеет связь с уменьшением кислородной емкости крови, уменьшением тканевого дыхания, или угнетением активности окислительных ферментов [6].

На сегодняшний день, широко используются в клинической практике биологически активные соединения универсального спектра действия, такие как препараты, содержащие янтарную кислоту, которые ингибируют процессы окисления и защищают клетки от токсического воздействия любой этиологии. В связи с чем, целью исследования стало изучение динамики гематологических показателей крови и особенности лейкограммы крыс с введением препарата Цитофлавин ® (НТФФ «Полисан», Санкт-Петербург).

Для решения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи: изучить влияние гипоксического воздействия на динамику красных клеток крови и эритроцитарного гемоглобина у крыс с моделируемой нормобарической гипоксией и крыс с сочетанным воздействием гипоксии и сукцинатсодержащего препарата; провести количественный и качественный анализ содержания лейкоцитов до и после воздействия гипоксии в группе животных с моделируемой нормобарической гипоксией и в группе крыс с сочетанным воздействием гипоксии и сукцинатсодержащего препарата; изучить изменение содержания тромбоцитов после курсовых гипоксических тренировок в группе с моделируемым гипоксическим воздействием и во второй группе, с применением препарата.

Материал и методы исследований. Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии Санкт-Петербургского государственного университета ветеринарной медицины. Эксперимент проводили на 60 белых крысах-самцах массой 250-284 г. в течение 21 дня.

Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования экстремальных условий и выведения крыс из опыта соответствовал принципам биоэтической комиссии, изложенным в требованиях Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

Погружение животных в условия гипоксии осуществляли ежедневно в течение 1 часа в условиях гипоксикатора «БИО-НОВА-204» (Москва), создавая обедненный кислородом воздух – 14 % с соблюдением нормального поддержания уровня влажности и вентиляции.

Животные были разделены на 3 группы, в каждой по 10 животных. 1 группа – интактные крысы, которые содержались в стандартных условиях вивария; 2 группа – контрольная, где крысы подвергались воздействию гипоксии по 1 часу ежедневно; 3 группа – подопытные, где животным перед гипоксической тренировкой (время экспозиции – 1 час) ежедневно внутрибрюшинно вводили, препарат Цитофлавин ® в дозе 135 мг/кг. Забой животных производили на 21 сутки (декапитация). Динамику изменения гематологических показателей оценивали по клиническому анализу крови животных и сдвигам лейкоцитарной формулы крови.

Статистическая обработка результатов проводилась посредством стандартного пакета программ MicrosoftOffice 2013. Для оценки достоверности различий выборок с ненормальным распределением данных применяли знаковый ранговый критерий Уилкоксона, используемый для сравнения двух связанных (парных) выборок. Для анализа значимых различий параметров выборок при нормальном распределении использовали t-критерий Стьюдента. Результаты считали достоверными при р<0,05.

Результат исследований. По результатам проведенных исследований было показано, что в условиях дефицита кислорода у крыс происходит снижение содержания красных клеток крови на 10 % (на 21 сутки) и эритроцитарного гемоглобина на 8,5 % (на 21 сутки), а также происходит снижение параметра – гематокритная величина на 10 % (на 21 сутки), что согласуется с результатами исследований, опубликованных нами ранее [2, 9, 11]. Вместе с тем, введение сукцинатсодержащих препаратов в условиях гипоксического воздействия сопровождалось сохранением содержания клеток крови относительно показателей контрольной группы, без применения препарата. На фоне использования препарата Цитофлавин ® содержание клеток красной крови оставалось в пределах нормы, а показатель содержания лейкоцитов, напротив, увеличивался относительно показателей группы контроля, что говорит о их большей реактивности в ответ на действие экстремальных факторов среды. Лейкоцитарный профиль подопытных крыс имел достоверные изменения относительно группы контроля. Так, было отмечено снижение содержания клеток агранулоцитарного ряда: моноциты на 85,5 % (на 21 сутки) и лимфоциты на 10 % (на 21 сутки). Установленные изменения, мы предполагаем, связаны с применением сукцинатсодержащего препарата и восполнением энергодефицита в клетках в анаэробном этапе цикла Кребса, что согласуется с литературными данными [3].

В группе 2 содержание лейкоцитов на 21 сутки имело тенденцию к увеличению (16,13±0,31 109/л) относительно контрольной группы крыс. Содержание тромбоцитов напротив имело достоверную тенденцию к снижению на 20 %, (р<0,05), эритроцитов на 10 % и гемоглобина на 8,5 %, по отношению к значениям контрольной группы и группы подопытных животных. В группе 3 – гипоксия+цитофлавин также наблюдалась однонаправленная тенденция к достоверному увеличению лейкоцитов на 30 % (р<0,050) и эритроцитов на 21 сутки эксперимента (Таблица 1). Параметры гемоглобин и тромбоциты достоверно снижались (р<0,05) на 21 сутки по сравнению с исходными значениями и показателями группы 1, а относительно 2 группы было, напротив, отмечено повышение содержание эритроцитов на 20 % и тромбоцитов на 15 %, (р<0,05) на 21 сутки. В результате эксперимента отмечен разнонаправленный характер изменений.

Таблица 1 – Клинические показатели периферической крови крыс в условиях воздействия гипоксии, М±m

Показатель	Контрольные группы		Подопытная группа
	1 группа интактные	2 группа гипоксия	3 группа гипоксия+цитофлавин
1 сутки
Лейкоциты, 109/л	15,04±0,05	15,34±0,22	15,21±0,15
Эритроциты, 1012/л	7,73±1,38	7,94±1,36	7,41±0,60
Гемоглобин, 10 г/л	157±0,03	153,6±0,06	156,5±0,53
Тромбоциты, 109/л	1111,87±1,28	1158,4±0,38	1130,5±1,27
21 сутки
Лейкоциты, 109/л	15,92±0,11	16,13±0,31	18,63±0,45*
Эритроциты, 1012/л	7,39±1,23	6,34±1,28	7,67±1,04
Гемоглобин, 10 г/л	157,2±0,04	141,1±0,04#*	143,5±0,36#*
Тромбоциты, 109/л	1111,29±1,66	939,6±0,81#*	1070,5±1,43*

Примечания: р – статистическая значимость различий параметров: * – полученных на 21 сутки, от показателей, полученных на 1 сутки; #–полученных на 21 сутки, от исходных.

Рисунок 1 – Динамика изменения лейкоцитарного состава крови у крыс исследуемых групп в условиях воздействия гипоксии, %

В группе 2 – гипоксия, у крыс отмечены достоверные изменения в лейкоцитарном составе крови: выявлена тенденция к снижению содержания лимфоцитов на 10 % и моноцитов на 87 % (р<0,05), вместе с тем содержание клеток гранулоцитарного ряда, напротив, достоверно увеличивается на 39с%, (р<0,05), относительно группы 1, интактных крыс. У крыс в группе 3 с использованием сукцинатсодержащего препарата, увеличилось общее число клеток белой крови (Таблица 1.) за счет увеличения содержания клеток гранулоцитарного ряда на 67 % (р<0,05) (Рисунок 1). Вместе с тем наблюдали тенденцию к снижению содержания лимфоцитов на 10 %.

Характерным признаком перераспределения лейкоцитов в условиях использования препарата Цитофлавин ® (группа 3- гипоксия+цитофлавин) является повышение количества клеток гранулоцитарного ряда, при этом содержание лимфоцитов и моноцитов сохраняется в пределах нормы в крови. Повышение количества пула клеток гранулоцитарного ряда необходимо для активации специфических и неспецифических иммунных реакций, поскольку они представляют собой мультифункциональные клетки, которые способны как к модуляции и распространению воспалительного процесса, так и инициации естественного и приобретённого иммунитета [1, 4].

Вместе с тем, в группе 2 - гипоксия наблюдали снижение содержания мононуклеарных фагоцитов в условиях воздействия гипоксии, что может быть связано со снижением неспецифической защиты организма, так как мононуклеары являются первыми, кто уничтожает и перерабатывает чужеродные антигены и учувствуют в синтезе гуморальных факторов иммунного ответа [13].

Заключение. В данном исследовании были выявлены характерные изменения клинических параметров периферической крови, в том числе соотношение различных классов лейкоцитов, у крыс при воздействии моделируемой гипоксии. Было отмечено, что в организме подопытных животных в условиях дефицита кислорода происходит каскад изменений, которые в свою очередь отражают состояние организма в ходе адаптации и развертывания компенсаторных механизмов. Последнее сопровождалось повышением количества клеток белой крови и тенденцией к снижению числа лимфоцитов, а также эритроцитарного гемоглобина.

Актуальность проблемы несомненна, поскольку воздействие любого стресс-фактора на организм животных индуцирует ряд метаболических и структурно-функциональных перестроек, что в свою очередь приводит к активации врожденных и приобретенных механизмов защиты организма.

Известно, что под влиянием стресс-фактора, который превышает порог чувствительности организма по длительности или силе своего действия, происходит нарушение нормального функционирования органов и тканей, и как следствие, различные паталогические процессы, которые в свою очередь могут приводит к развитию заболеваний [7].

По результатам проведенного нами исследования было выявлено, что введение сукцинатсодержащего препарата в сочетании с применением интервальных тренировок гипоксией приводило к успешному сохранению содержания в периферической крови всех форменных элементов и гемоглобина на 21 сутки после воздействия стресс-фактора. К завершению опыта наблюдали наиболее яркую ответную реакцию от воздействия гипоксии для лейкоцитов и тромбоцитов по сравнению с исходными значениями и группой 1 интактных крыс. Наблюдаемые изменения можно объяснить повышенным уровнем сенсибилизации клеток крови, синтезируемых красным костного мозгом, к дефициту кислорода, и как следствие активации компенсаторноприспособительных реакций, увеличением напряжённости иммунной системы и способности костного мозга к синтезу тромбоцитов и лейкоцитов [8, 10].

Курс часовых интервальных тренировок гипоксии вызвал у подопытных крыс повышение количества отдельных форменных элементов и гемоглобина в крови на последний день эксперимента (21 сутки), что согласуется с результатом, полученным другими группами ученых при исследовании влияния дефицита кислорода на организм [5, 12]. Наблюдаемые перестройки в работе кровеносной и дыхательной систем органов поясняются увеличением уровня насыщения кислородом крови посредством выхода форменных элементов крови из красного костного мозга и его стимуляцией за счет понижения активности окислительной деградации липидов в мембранах клеток [2, 14].

Исходя из приведенных нами данных исследования, мы использовали интервальные гипоксические тренировки в качестве модели дефицита кислорода, а препарат Цитофлавин вводили для восполнения энергодефитцита и защиты клеточных мембран. По результатам была отмечена положительная динамика изменений количественного содержания форменных элементов крови исследуемых животных на 21 сутки и восстановление их значений до исходного уровня. Вместе с тем, было показано, что численное содержание эритроцитарного гемоглобина при этом сохранялось достоверно пониженным. Наблюдаемые изменения можно связать с деструктивным влиянием гипокси-гиперкапнического воздействия на эритроцитарные мембраны, и как следствие, их разрушение с выходом гемоглобина в периферический кровоток. Это можно объяснить тем, что некоторые белки, входящие в состав мембран клеток, обладают значительной чувствительностью к дефициту кислорода [15].

Было проведено исследование динамики лейкоцитов крови крыс-самцов в условиях нормоксии и при моделировании гипоксии до и после использования сукцинатсодержащего препарата Цитофлавин ®. Животные были разделены на три группы: две контрольные группы животных: группа 1 – интактные крысы, содержащихся в стандартных условиях вивария, и группа 2, которые подвергались часовому гипоксическому воздействию, и группа 3-подопытных животных подвергающиеся ежедневным тренировкам в гипоксикаторе (O 2 -14%) и получавшие препарат непосредственно перед тренировкой. Определены разнонаправленные сдвиги, характеризующие морфофункциональное состояние белой крови крыс в условиях эксперимента. У животных группы 2 по сравнению с группой 3 отмечено снижение числа лейкоцитов за счет увеличению пула клеток гранулоцитарного ряда, и неизменном уровне агранулоцитов с тенденцией к уменьшению количества лимфоцитов.

В группе 2 по сравнению с группой 3 изменение количества лейкоцитов и их субпопуляционного состава достоверно отличалось от контрольной группы 1, интактных крыс, отмечено понижение числа фагоцитирующих мононуклеаров и увеличение клеток гранулоцитарного ряда.

Отличия в клеточном составе крови у животных группы 2 от данных группы 3 рассматриваются как влияние сукцинатсодержащего препарата Цитофлавин ® на подготовку организма к реализации защитной функции при воздействии экстремальных факторов и напряжению резистености организма нагрузке, поскольку характер перераспределения лейкоцитарного состава крови в группе 2 имеет значительное сходство по показателям с животными в группе 3. Практическое значение выполненного исследования связано с поиском новых биологически активных веществ, оптимально воздействующих на способность организма животных адаптироваться к условиям пониженного содержания кислорода. Новые данные о механизме перераспределения крови животных, реализующемся в условиях действия сукцинатсодержащего препарата Цитофлавин ® в условиях дефицита кислорода, могут быть использованы при исследовании закономерностей проявления срочного адаптационного эффекта.