Структурно-функциональные изменения эпидермиса и дермы кожи белых крыс после высоко-кинетического механического повреждения

Структурно-функциональные механизмы заживления раны кожи после повреждающего механического воздействия хорошо изучены. Широко обсуждаемая концепция о гистионе позволяет по-новому оценить фазность течения раневого процесса с учетом взаимоотношения клеток различных дифферонов в гистионе и его последующей трансформации при заживлении раны [1, 2, 5, 4]. В этой связи возникает необходимость оценки влияния трансформаций гистиона на структурно-функциональные изменения кожи с применением морфометрического анализа в сочетании с оценкой пролиферативной и функциональной активности клеток различных дифферонов в динамике раневого процесса, что и послужило целью настоящего исследования.

Материал и методы исследования

Эксперимент проведен на 30 белых беспородных крысах обоего пола массой 180–200 г в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755). Основную группу (n = 25) составили животные, которым травму кожи бедра вызывали с помощью специальной установки (падающий груз), моделирующей высококинетическое повреждение тканей [5]. Эксперимент проводили под эфирным наркозом. Фрагмент кожи (0,5х1,5 см) в зоне повреждения и вокруг нее для морфологического исследования забирали через 6 ч (n = 5), 1 (n = 5), 3 (n = 5), 7 (n = 5) и 15 (n = 5) сут после травмы. Животных декапитировали под эфирным наркозом. Контрольную группу составили интактные животные (n = 5).

Образцы кожи фиксировали в 10%-ном растворе формалина на фосфатном буфере фирмы ООО «Биовитрум». Материал заливали в парафин по общепринятой методике [6]. Срезы толщиной 4–5 мкм делали на ротационном микротоме LaboCut 4055 (фирма Slee,

Германия). Для микроскопии срезы окрашивали гематоксилином и эозином, методом Ван-Гизон, заключали в канадский бальзам. На этих препаратах оценивали структурно-функциональные изменения поврежденной кожи [7].

Для определения пролиферативной активности клеток кожи, верификации эпителиальных клеток эпидермиса и волосяных влагалищ использовали иммуногистохимический метод с мечеными моноклональными антителами соответственно к белку Ki-67 и Сk-14 по методикам, рекомендованным фирмой – производителем.

Микрофотосъемку гистологических препаратов проводили на микроскопе Axio Scope 40 (Carl Zeiss) и Axio Star (Carl Zeiss) с встроенным ТV-адаптером и цифровой видеокамерой Carl Zeiss Imager, A1, окуляр W-PI 10x/23, объективы: Achroplan 20х/0,45, 40x/0,60, 63x/0,80 и 100x/1,25 oil. Морфометрический анализ проводили согласно общепринятым рекомендациям [7] с использованием программы ImageJ. На микрофотографиях (окраска гематокиси-ном-эозином и по Ван-Гизону) поперечных и тангенциальных срезов кожи животных контрольной и основной групп (по 5 срезов с каждого животного) определяли толщину (мкм) эпидермиса, дермы, гиподермы, объемную плотность (%) коллагена, сальных желез, эпителия волосяных влагалищ, микрососудов, численную плотность фибробластов (на 1 мм2 плоскости среза дермы), а также измеряли угол наклона, расстояние между волосками (мкм) и характер распределения волос. На иммуногистохимических препаратах определяли численную плотность Кi-67 позитивных клеток (индекс пролиферации) на 100 клеток данного типа и объемную плотность клеток, содержащих Сk-14 (эпителиальные клетки эпидермиса и волосяных влагалищ).

Статистический анализ полученных результатов осуществляли с использованием программы Statistica 6.0. Проверку статистических гипотез проводили с помощью непараметрических методов (критерий Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, ANOVA Краскела-Уоллиса), а для относительных величин – критерия Фишера двустороннего и вычисления 95% доверительного интервала [8].

Результаты исследования

В коже интактных белых крыс эпидермис в среднем имеет толщину (ширина на поперечном срезе – 12,6 ± 1,6 мкм), представлен базальным слоем мелких эпителиоцитов, которые в некоторых участках черепицеобразно накладываются друг на друга, 2–3 рядами шиповатых эпителиоцитов, зернистыми клетками и роговыми эпителиоцитами.

Дерма занимает основную часть (ширина на поперечном срезе – 585 ± 125 мкм) кожи и границы переходят в подкожную жировую клетчатку. Сосочковый слой дермы сглажен, сосочки в нем располагаются редко. Субэпидермальная рыхлая соединительная ткань проникает в сетчатый слой дермы, окружая железы и волосяные фолликулы. В норме ведущим клеточным диффероном дермы является фибробластический (420 ± 60 клеток/1 мм2). Коллагеновые волокна занимают 65,5 ± 7,0, а эластические – 3,1 ± 1,5, микрососуды – 1,5 ± 0,5% дермы.

Эпителиоциты в наружном волосяном влагалище контрольных животных расположены циркулярно 2–3 слоями клеток. Волосы кожи расположены в гексагональном порядке на расстоянии 163,5 ± 22,5 мкм друг от друга под углом 60–68 градусов (95% доверительный интервал средней). Волосяные луковицы находятся в подкожной жировой клетчатке. Сальные железы имеют разветвленные концевые отделы, представленные одной-двумя дольками, которые занимают 8,9 ± 2,8% объема дермы. Глубже сетчатого слоя дермы расположена гиподерма (ширина на поперечном срезе – 265 ± 86 мкм). В ней присутствует большое количество адипоцитов. По данным иммуногистохимического исследования кожи интактных крыс установлено, что степень пролиферативной активности клеток базального слоя эпидермиса и клеток дермы низкая.

Дисперсионный анализ (ANOVA Краскела-Уоллиса) результатов гистологического и иммуногистохимического морфометрического исследования тканей кожи в перинекротиче-ской зоне показал, что в течение 15 сут наблюдения статистически значимо изменялись та- кие показатели, как толщина эпидермиса (df = 4, n = 125, Н = 29,8, p = 0,001), объемная плотность коллагена (df = 4, n = 125, Н = 15,8, p = 0,03), эпителия волосяных влагалищ (df = 4, n = 125, Н = 17,6, p = 0,01), микрососудов (df = 4, n = 125, Н = 19,8, p = 0,01), численная плотность фибробластов (df = 4, n = 125, Н = 14,6, p = 0,04), угол наклона волос (df = 4, n = 125, Н = 16,5, p = 0,02), расстояние между волосками (df = 4, n = 125, Н = 22,5, p = 0,001), численная плотность волос и характер их распределения. Динамика изменений показателей, характеризующих структурно-функциональное состояние перинекротической зоны кожи и парный сравнительный анализ с контролем и между сроками исследования, показана в таблице.

Морфометрические показатели перинекротической зоны кожи бедра белых крыс контрольной и основной группы

Примечание . «*» – различия статистически значимы в сравнении с контролем при p < 0,05, «**» – при p < 0,01 и «***» – при p < 0,001; «^» – различия статистически значимы в сравнении с предыдущим сроком при p < 0,05, «^^» – при p < 0,01 и «^^^» – при p < 0,001 (критерий Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни для парных сравнений независимых выборок. Г – гексагональное, С – симметричное, А – асимметричное, ДИ – доверительный интервал.

Изменения объемной плотности через 6 ч, 1 и 3 сут после травмы связаны с отеком пе-ринекротической зоны, а в более отдаленном периоде (7, 15 сут) – с активацией процессов репаративной регенерации. Увеличивается количество клеток с высоким содержанием ядерно-го белка Кi-67 (таблица), происходит гиперплазия и гипертрофия клеток эпидермиса, волосяных влагалищ, клеток фибробластического дифферона, макрофагов и эндотелиальных клеток.

Через 7 сут после травмы прилежащий краям раны эпителий гипертрофирован. Особенно наглядно это видно на иммуногистохимических препаратах. Толщина эпидермиса в среднем составляла 63,7 ± 5,6 мкм (9–10 слоев клеток). На границе с раной край эпителиального пласта узким клином входил на раневую поверхность. К этому сроку эпителий продвинулся на раневую поверхность на расстояние 0,4–0,5 мм. Под ним выявлялась молодая рыхлая соединительная ткань.

Через 15 сут после травмы у всех животных поверхность дефекта была эпителизирова-на. Эпителий состоял из 4–6 слоев клеток (толщина около 20 мкм) и ороговевающих напластований. Клетки эпителия уплощены, с вытянутыми ядрами, длинная ось ядра располагалась параллельно поверхности дефекта. Рыхлая соединительная ткань под эпителием (толщина 40–90 мкм) состояла из тонких волоконец и клеточных элементов с преобладанием фибробластов. В периферической области дефекта увеличивалось количество эластических волокон. Волокнистые структуры соединительной ткани, заполняющей центральную часть дефекта, имели вид сетки.

Таким образом, после высококинетического механического повреждения кожи бедра белой крысы в перинекротической зоне происходит выраженная реактивная и компенсаторно-восстановительная реорганизация структурных образований кожи. Изменяется соотношение толщины слоев кожи, объемных долей коллагеновых волокон, эпителиальных клеток волосяных влагалищ, микрососудов, численная плотность волос и их пространственное распределение, клеточный состав. Динамика выявленных изменений тканевых структур в значительной степени определяется гетерохронной активацией механизмов пролиферации клеток ведущих дифферонов эпидермиса и дермы.