Ступенчатый отбор высокопродуктивных по целлюлазной активности колоний гриба Trichoderma viride

Ферментативный гидролиз целлюлозы происходит в результате последовательно-параллельного действия нескольких ферментов, входящих в

состав так называемого целлюлазного комплекса [1-4]. Целлюлазы, катализирующие гидролиз р-1,4-гликозидных связей целлюлозы, принадлежат к группе гликозидгидролаз и состоят из трех основных типов ферментов: эндоглюканазы (КФ 3.2.1.4), целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91) и р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21). Эндоглюканазы неупорядоченно гидролизуют в целлюлозе р-1-4-гликозидные связи с образованием целлоолигосахаридов. Целлобиогидролазы отщепляют целлобиозу с нередуцирующих концов целлоолигосахаридов, а р-глюкозидазы, или целлобиазы, гидролизуют целлобиозу, высвобождая две молекулы глюкозы [1,5, 6].

Наиболее известными и используемыми в промышленности продуцентами целлюлаз являются грибы рода Trichoderma (Т. reesei, Т. viride). Они конвертируют целлюлозную биомассу до глюкозы, которая может быть использована для различных целей, таких как производство биоэтанола, в кормах для животных, в очистке сточных вод и пивоваренной промышленности [7, 8].

Одной из проблем промышленной биотехнологии является то, что многие штаммы-продуценты ферментов, в том числе и целлюлаз, в процессе периодических пересевов снижают свою активность. Это уменьшает выход целевого продукта и отрицательно сказывается на экономике производства. Решением данной проблемы является селекция высокопродуктивных штаммов-продуцентов ферментов [9].

То есть, наряду с поиском новых микроорганизмов с высоким уровнем биосинтеза внеклеточных ферментов, значительное развитие получили исследования по селекции более активных мутантов как новых, так и отобранных ранее [10].

Начало интенсивной селекции штаммов-продуцентов гидролитических ферментов было положено в 70-х г. XX в. работами Мандельс с сотрудниками, сообщившими о получении двух мутантов гриба Trichoderma reesei, обладавших высокой целлюлазной активностью. Авторы использовали традиционный селекционный прием обработки штамма дикого типа мутагенными факторами в сочетании со ступенчатым отбором. В результате общую активность внеклеточных целлюлаз, образуемых этой культурой, удалось повысить сначала в два, а затем еще в 1,4 раза [11, 12].

Для получения высоких уровней активности внеклеточных ферментов целлюлаз проводят оптимизацию параметров ферментации микроорганизмов - продуцентов ферментов, включая состав питательной среды для культивирования, оптимальные время культивирования, pH среды и температура культивирования [13]. Для повышения выхода целлюлаз, их активности и стабильности используют различные методы селекции и мутагенеза [14, 15].

Цель работы - отбор высокопродуктивных по целлюлазной активности колоний штамма Trichoderma viride ВКПМ F-13/10 на основе трудногидролизуемых целлюлозных материалов - фильтровальная бумага и целлюлоза производства «Монди Сыктывкарский ЛПК».

Материалы и методы

Объект исследования - продуцент целлюлолитических ферментов штамм мицелиального гриба Trichoderma viride ВКПМ 13/10 (F-120). Культуру поддерживали на агаризованной среде Ролена-Тома (РТ) при температуре +4° С.

В качестве посевного материала использовали споровые суспензии Т. viride 13/10 в стерильной дистиллированной воде. Засев производили в расчете 0,5 мл споровой суспензии на 100 мл жидкой питательной среды. За основу была принята питательная среда Ролена-Тома (РТ) следующего состава (%): C₄H₄O₆(NH₄)₂ - 0,33; КН₂РО₄ - 0,2; K₂SO₄ - 0,02; MgSO₄x7H₂O - 0,02; кукурузный экстракт - 1,0; раствор микроэлементов - 0,1 мл на 100 мл среды. Раствор микроэлементов имел следующий состав (%): MnSO₄x5H₂O - 0,008; CuSO₄x 5Н₂О - 0,04; ZnSO₄x7H₂O - 0,08; Co(NO₃)₂x6H₂O -0,01; FeSO₄x7H₂O - 0,1; (NH₄)₆Mo₇O₂₄x4H₂O - 0,03; H3BO3- 0,006; CaCI ₂x6H₂O - 0,1.

Другой питательной средой для культивирования Т. viride 13/10 служила разработанная нами среда, обозначенная как среда № 1, следующего состава (г/л): (NH₄)₂SO₄ - 5,0; MgSO₄x7H₂O - 0,5; КН₂РО₄ - 2,0; раствор микроэлементов - 0,1 мл на 100 мл среды. Раствор микроэлементов имел состав, аналогичный таковому для среды РТ.

Легкометаболизирумыми источниками углерода в среде для культивирования Т. viride являлись сахароза (2 %) или Na-карбоксиметилцеллю-лоза (Na-КМЦ, 2 %). Трудногидролизуемыми лигноцеллюлозными материалами служили фильтровальная бумага Ватман № 1 и целлюлоза производства «Монди Сыктывкарский ЛПК».

При получении плотной агаризованной среды к жидкой среде добавляли 3 % агара.

Культуру гриба выращивали в колбах при перемешивании (220 об/мин) с объемом питательной среды 100 мл при 24° С. Исходное значение pH среды было 5,0 без дальнейшего регулирования в процессе культивирования.

Общую целлюлазную активность по осахариванию фильтровальной бумаги (АФБ) определяли по методу Родионовой с соавт. [16]. Полоски фильтровальной бумаги размером 1 смхб см помещали в две стеклянные пробирки, в которые добавляли 1 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера (pH 5,0) и 1 мл соответствующе разбавленного ферментного раствора. Пробирки инкубировали в водяном термостате при 50 °C в течение 1 ч., после чего из каждой пробирки отбирали по 1 мл раствора и определяли в них редуцирующие сахара по методу Нельсона-Шо-моди [17, 18]. За одну единицу АФБ принимали такое количество фермента, которое освобождало при данных условиях из фильтровальной бумаги 1 мкмоль эквивалентов глюкозы за 1 ч.

Вес сухой биомассы определяли центрифугированием грибных культур в пробирках Эппен-дорфа, после чего пробирки высушивали до постоянного веса при 60 °C.

Цифровые данные в статье представляют собой средние величины, полученные в результате трех независимо проведенных друг от друга экспериментов.

Результаты и обсуждение

Метод одно- и многоступенчатого отбора, применяемый в научных исследованиях при селекции высокоактивных продуцентов ферментов, довольно трудоемок и для получения штаммов со значительным увеличением активности ферментов требуется продолжительное время. Поэтому для ограничения числа вариантов, проверяемых в ходе отбора, создают селективные условия для первичной оценки мутантов по признаку, легче тестируемому, чем продуктивность культуры в отношении биосинтеза ферментов. В этом случае отбор мутантов проводят на агаризованных средах с трудноме-таболизируемым субстратом, основываясь на признаке размера колоний. У более крупных колоний затем проверяют активность ферментов [11, 19]. Поэтому в нашей работе в процессе ступенчатого отбора высокоактивных по целлюлазной активности колоний гриба Trichoderma viride в качестве трудно-метаболизируемых субстратов мы использовали фильтровальную бумагу Ватман № 1 и целлюлозу, произведенную на «Монди Сыктывкарский ЛПК».

Определение исходной целлюлазной активности гриба Trichoderma viride ВКПМ 13/10 (F-120). Исходная культура Т. viride 13/10 в течение более чем 20 лет хранилась в пробирках на скошенной агаризованной среде Ролена-Тома РТ с 2 % сахарозы при температуре +4 °C при регулярных пересевах на свежие питательные среды один раз в два-три месяца. В пробирку с культурой Т. viride

Таблица 1 Исходная общая целлюлазная активность по осахариванию фильтровальной бумаги (АФБ) штамма Trichoderma viride 13/10

Table 1 Initial total cellulase activity for saccharification of filter paper (FPA)of strain Trichoderma viride 13/10

Время, сутки	Вес сухой биомассы,г/л	АФБ,ед/мл	Удельная АФБ,ед/мг с.б.
4	2,7	0,8	0,3
5	3,0	0,9	0,3

Таблица 2

АФБ отобранных no морфологическим показателям роста колоний Trichoderma viride 13/10 через двое суток культивирования в жидкой среде РТ с 2 % сахарозы

Table 2

FPA of Trichoderma viride 13/10 colonies selected according to morphological growth parameters after 2 days of cultivation ina liquid RT medium with 2 % sucrose

Колония	Вес сухой биомассы, г/л	АФБ, ед/мл	Удельная АФБ, ед/мг с.б.
1-1	12,9	1,4	0,11
1-2	11,6	1,3	0,11
2-1	11,9	0,8	0,07
2-2	12,8	0,5	0,04
3-1	11,4	0,1	0,01
3-2	11,3	0,2	0,02

13/10 добавляли 5 мл стерильной дистиллированной воды с целью получения суспензии спор. Из пробирки со споровой суспензией Т. viride были засеяны колбы со 100 мл жидкой питательной среды РТ, содержащей в качестве источника углерода 2 % сахарозы. Засев производили из расчета 0,5 мл споровой суспензии на 100 мл среды. Культивирование проводилось на качалке (220 об/мин) при температуре 24 °C. Через 4 и 5 суток были определены вес сухой биомассы и в фильтратах культуральной жидкости - общая целлюлазная активность по осахариванию фильтровальной бумаги -АФБ (табл. 1).

Как видно из табл. 1, исходная целлюлазная активность культуры гриба Т. viride составляла 0,80,9 ед/мл АФБ, а удельная АФБ - 0,3 ед/мг с.б.

Культивирование Т. viride 13/10 на плотной агаризованной среде. На 1-м этапе ступенчатого отбора культуру гриба Т. viride рассевали в чашки Петри на поверхности плотной агаризованной среды РТ, содержащей в качестве источника углерода 2 % сахарозы, с целью получения изолированных колоний. Исходная споровая суспензия гриба была разведена в 10⁶раз. Затем отбирали по 0,1 мл разведенной споровой суспензии и растирали ее стерильным шпателем Дригальского в чашках Петри по поверхности плотной среды. Выращивание колоний проводили в термостате при 28 °C. Каждая отдельная спора Т. viride давала отдельную, изолированную колонию и через семь суток культивирования отбирали колонии визуально по морфологическим признакам (диаметр колонии) с наилучшими, и в качестве контроля - со средними и наихудшими показателями роста. Отобранные колонии были обозначены следующим образом: 1-1, 1-2 - колонии с наилучшими показателями роста; 2-1, 2-2 - со средними показателями; 3-1, 3-2 - колонии с наихудшими показателями роста.

Отобранные колонии Т. viride культивировали в жидкой питательной среде РТ с 2 % сахарозы. Предварительно из центра каждой колонии гриба микробиологической иглой были вырезаны диски с культурой, которые были перенесены в соответствующую колбу с жидкой средой РТ. После двух суток культивирования определяли вес сухой биомассы и общую целлюлазную активность (табл. 2).

Как видно из табл. 2, колонии с наилучшими морфологическими показателями роста синтезировали больше всего целлюлаз. АФБ их составляет 1,3-1,4 ед/мл, а удельная АФБ - 0,11 ед/мг сухой биомассы (с.б.). Несколько ниже целлюлазная активность была в фильтратах после культивирования колоний со средними показателями роста: 0,5-0,8 ед/мл АФБ и удельная АФБ -0,04-0,07 ед/мг с.б. Колонии с наихудшими морфологическими показателями роста обладали довольно низкой целлюлазной активностью на порядок ниже по сравнению с колониями с наилучшими морфологическими показателями роста: 0,1-0,2 ед/мл АФБ, удельная АФБ - 0,01-0,02 ед/мг с.б.

Таким образом, АФБ колоний с наилучшими морфологическими показателями роста увеличилась от исходной 0,7-0,8 до 1,3-1,4 ед/мл.

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что у штамма Т. viride 13/10 обнаруживается взаимосвязь между интенсивностью роста культуры и синтезом целлюлолитических ферментов. Чем более активный рост культуры на плотной среде, тем более интенсивно происходит синтез целлюлаз.

Культивирование Т. viride 13/10 на плотной агаризованной среде с трудногидролизуемым лигноцеллюлозным материалом. На втором этапе селекции культуры Т. viride 13/10, отобранные по морфологическим показателям роста, пересевали из колб в чашки Петри с агаризованной средой РТ, содержащей в качестве источника углерода трудногидролизуемый субстрат - фильтровальную бумагу Ватман № 1 (ФБ) или целлюлозу (Ц) производства «Монди Сыктывкарский ЛПК». В плотной среде вырезали лунки, в которые засевали культуры Т. viride (1-1, 1-2, 2-1,2-2, 3-1, 3-2): по 0,2 мл культуры из колб в каждую лунку. После этого чашки Петри помещали в термостат для выращивания при 28 °C в течение 10 суток.

Таблица 3

АФБ выросших на плотной среде РТ с трудногидролизуемым субстратом колоний Trichoderma viride 13/10 через пять суток культивирования в жидкой среде РТ с 2 % сахарозы

Table 3

FPA of colonies of Trichoderma viride 13/10 grown on a dense RT medium with a hardly hydrolysable substrate after 5 days of cultivation in a liquid RT medium with 2% sucrose

Колония	Субстрат	Вес сухой биомассы, г/л	АФБ, ед/мл	Удельная АФБ, ед/мг с. б.
1-1	ФБ	6,2	2,0	0,32
1-2	ФБ	9,4	2,4	0,26
2-1	ФБ	7,0	0,7	0,10
2-2	ФБ	9,3	0,7	0,08
3-1	ФБ	7,1	0,1	0,01
3-2	ФБ	7,1	0,3	0,04
1-1	Ц	6,1	2,2	0,36
1-2	Ц	8,7	2,5	0,29
2-1	ц	7,7	0,8	0,10
2-2	Ц	7,9	0,9	0,11
3-1	Ц	7,6	0,2	0,03
3-2	Ц	6,9	0,4	0,06

Далее выросшие в лунках колонии пересевали в колбы с жидкой питательной средой РТ, содержащей в качестве источника углерода 2 % сахарозы. Через пять суток культивирования Т. viride на качалке были определены вес сухой биомассы и в фильтратах - общая целлюлазная активность (табл. 3).

Как видно из табл. 3, после выращивания Т. viride на плотной среде с трудногидролизуемым субстратом и дальнейшего культивирования колоний на жидкой среде РТ с 2 % сахарозы общая целлюлазная активность несколько увеличилась как в случае фильтровальной бумаги, так и в случае целлюлозы. АФБ колоний, отобранных по наилучшим морфологическим показателям роста, увеличилась до 2,0-2,5 ед/мл, что выше по сравнению с исходной активностью в 2,9-3,1 раза. АФБ других колоний повысилась незначительно.

Для дальнейшей селекции была отобрана колония 1-2 Т. viride 13/10, секретирующая в жидкой среде достаточно большое количество целлюлаз (АФБ 2,4 ед/мл).

Колонию 1-2 пересевали из колбы в чашки Петри с агаризованной средой № 1, содержащей в качестве источника углерода фильтровальную бумагу. В плотной среде вырезали лунки, в которые вносили по 0,2 мл жидкой культуры колонии 1-2 Т. viride 13/10. Чашки помещали в термостат при 28 С для выращивания колоний в течение 10 суток.

После этого визуально по морфологическим показателям роста и степени деструкции фильтровальной бумаги были отобраны пять колоний Т. viride; Т-1, Т-2, Т-3, Т-4, Т-5.

Далее отобранные колонии Т. viride пересевали в колбы с жидкой питательной средой № 1, содержащей в качестве источника углерода 2 % Na-КМЦ. Че-

Таблица 4

АФБ выросших на плотной среде № 1 с фильтровальной бумагой колоний Trichoderma viride 13/10 через пять суток культивирования в жидкой среде № 1 с 2 % Na-КМЦ

Table 4

FPA of colonies of Trichoderma viride 13/10 grown on a dense medium No. 1 with filter paper after 5 days of cultivation in a liquid medium No. 1 with 2 %

Na-CMC

Колония	Вес сухой биомассы, г/л	АФБ, ед/мл	Удельная АФБ, ед/мг с. б.
Т-1	4,2	2,8	0,67
Т-2	3,8	2,4	0,63
Т-3	4,5	3,3	0,73
Т-4	4,0	2,6	0,65
Т-5	4,1	2,5	0,61

рез пять суток культивирования при 28 °C были определены вес сухой биомассы и в фильтратах - общая целлюлазная активность (табл. 4).

Как видно из табл. 4, общая целлюлазная активность по сравнению с колонией 2-1 не увеличилась для колонии Т-2 (АФБ 2,4 ед/мл), но у остальных четырех колоний активность возросла до 2,5-3,3 ед/мл.

На основании наибольшей целлюлазной активности (АФБ - 3,3 ед/мл, удельная АФБ -0,73 ед/мг с.б.) для дальнейшей селекции была использована колония Т-3 Т. viride 13/10.

В последующих пяти проведенных циклах селекции колония Т-3 Т. viride 13/10 рас-севалась на плотную среду № 1 с фильтровальной бумагой. На основании степени гидролиза фильтровальной бумаги отбирались

наиболее активные колонии, АФБ которых проверялась при культивировании в колбах на жидкой среде №1 с 2 % Na-КМЦ.

В результате проведенных экспериментов была отобрана колония Т-36, обладающая наибольшей целлюлазной активностью (АФБ - 5,6 ед/мл, удельная АФБ - 1,4 ед/мг с.б.) по сравнению со всеми другими испытанными колониями Т. viride 13/10.

Культура Т. viride с наибольшей целлюлазной активностью была пересеяна в пробирки со скошенной агаризованной средой РТ для хранения при температуре +4 С. Полученная колония Т. viride с высокой целлюлазной активностью в лиофилизированном состоянии может храниться долгое время без снижения своей продуктивности.

Заключение

На основании проведенных исследований можно заключить, что в результате ступенчатого отбора высокопродуктивных по целлюлазной активности колоний гриба Trichoderma viride отобрана колония с высокой целлюлазной активностью. При этом, общая целлюлазная активность отобранной колонии штамма Т. viride ВКПМ F-13/10 по сравнению с исходной активностью была увеличена в 6,27,0 раза. Дальнейшая селекция, особенно с использованием мутагенных факторов, может еще больше повысить уровень синтеза целлюлаз культурой гриба Т. viride.

Исследования проведены в рамках темы НИР ГР №АААА-А 17-117121270025-1.