Сухая гниль подсолнечника и дополнительные дифференцирующие признаки видов рода Rhizopus Ehrenb

Введение. В последнее время наблюдается нарастание поражения корзинок подсолнечника сухой гнилью. Количество заболевших корзинок колеблется от 20 до 60 %. По данным R. Harveson, частота встречаемости болезни может достигать 85–100 % [1]. В литературных источниках это заболевание упоминается под двумя названиями: бурая сухая и сухая гниль [2; 3]. Болезнь зарегистрирована в Югославии, Болгарии, Португалии, Испании, Австралии, Иране, США, Израиле, Индии, Канаде [4; 5; 6; 7]. В России сильное распространение и вредоносность сухой гнили на посевах подсолнечника зафиксированы на Северном Кавказе, в южной части Центральной Черноземной зоны (ЦЧЗ), в Среднем Поволжье, на юге Урала и Сибири [8].

Впервые признаки болезни на подсолнечнике описал М.А. Целле в 1932 г. Симптомы проявления сухой гнили очень похожи на признаки поражения корзинки серой и белой гнилями [9]. Заражение происходит в фазе цветения спорами и мицелием, которые разносятся ветром, птицами и насекомыми. Для развития возбудителя сухой гнили требуется зрелая поврежденная ткань корзинки [10]. Проявляется болезнь в фазе созревания подсолнечника. Сохраняется инфекция в послеуборочных остатках больных корзинок и в семенах.

Вредоносность болезни в сильной степени зависит от погодных условий во время вегетации подсолнечника. При благоприятных условиях развития патогена потери урожая достигают 20–40 %. У семянок снижается масличность семян, ухудшаются посевные качества [11; 12; 13; 14].

Возбудители сухой гнили относятся к широко распространенному в природе семейству Mucoraceae , классу Zygomycetes, роду Rhizopus . Первые диагностические признаки рода были описаны немецким ученым C.G. Ehrenberg в 1820 г. Основой рода стал вид гриба Mucor stolonifer, переименованный C.G. Ehrenberg в Rhizopus nigricans Ehrenb. За эти годы опубликовано несколько таксономических систем грибов рода Rhizopus

Ehrenb. и описано более 100 видов. Дифференциация видов осуществлялась по морфологическим признакам бесполого спороношения, росту на различных субстратах и способности вызывать брожение. Определение видов по этим диагностическим признакам приводило к неточностям и затрудняло идентификацию. Ревизию рода проводили ученые A. Len-dner (1908), J. Hanzawa (1915), H. Zycha (1935), H. Zycha et all. (1969), Н.А. Наумов и др. (1935/1939), T. Inui (1965), M. Scholer (1970), M. Scholer и E. Muller (1971). Авторы в пределах рода выделяли разное количество видов [15; 16].

В 1984 г. голландские ученые Schipper и Stalpers разработали новую классификацию грибов рода Rhizopus Ehrenb. [15]. Основной ее особенностью является дифференциация рода по температурному максимуму роста патогена на субстрате на группы: « stolonifer», «microsporus», «oryzae» . Исследования по ДНК-гибридизации, проведенные американским ученым J.J. Ellis, подтвердили обоснованность выделения групп видов [17]. В группе определение вида осуществляется по признакам половой репродукции, а идентификация разновидностей проводится по морфологическим особенностям бесполого спороношения. Согласно новой систематике род Rhizopus Ehrenb. состоит из 5 видов и 8 разновидностей. Многие названия видов перешли в разряд синонимов [15; 16].

Г.А. Кочкина с соавторами (1989) на основании проведенных морфологических и физиологических исследований рода Rhizopus предложили температурный максимум роста грибов устанавливать по радиальной скорости роста мицелия на агаре. При идентификации грибов рода Rhizopus Ehrenb. учитывать орнаментацию оболочки спорангиоспор, а также соотношение между размерами спорангия и спорангиоспор между группами. Используя эти показатели и диагностические признаки видов грибов рода Rhizopus Ehrenb., описанные в работе

Schipper (Schipper, 1984), они провели ревизию коллекционного материала рода Rhizopus (70 штаммов), хранящегося в ВКМ под 10-ю видовыми наименованиями. В результате пересмотра оказалось, что штаммы относятся к 3 видам (4 разновидностям): Rh. stolonifer var. stolonifer, Rh. oryzae, Rh. microsporus var. micro-sporus, Rh. microsporus var. chinensis и Rh . microsporus var. оligosporus [16].

В научных публикациях возбудитель сухой гнили подсолнечника описывается под разными видовыми названиями. Это связано с тем, что авторы для определения видов используют очень незначительные морфо-биологические особенности патогена. По данным отечественных исследователей, возбудителями бурой сухой гнили на подсолнечнике являются виды Rhizopus nigricans Ehrenb. и Rhizopus nodosus Namysl. [9; 18]. Югославские ученые сообщают о трех представителях рода Rhizopus Ehrenb.: Rh. arrhizus Fisch., Rh. nigricans Ehrenb., Rh. oryzae Went et Pringle [5]. В Италии, США распространен Rh. oryzae Went et Pringle [4; 19]. Вид Rh. arrhizus Fisch. считается основным возбудителем на посевах подсолнечника в США, Индии, Израиле [6; 10]. В штатах Техас и Миннесота встречается Rh. stolonifer Ehrenb.: Fr. Vuill. [20]. В штатах Колорадо, Вайоминг, Небраска сухая гниль вызвана несколькими видами этого рода: Rh. stolonifer, Rh. arrhizus, Rh. оrуzае и Rh. microsporus [1].

По результатам наших исследований, сухую гниль корзинок подсолнечника в Краснодарском крае вызывают три вида грибов рода Rhizopus Ehrenb.: Rh. oryzae Went et Pringle, Rh. stolonifer (Ehrenb.: Fr.) Vuill. var . stolonifer и Rh. microsporus V. Tiegh. var. microsporus (рис. 1).

Доминирующим является вид Rh. оryzae Went et Pringle, частота встречаемости которого достигает 91,2 %. Распространенность вида Rh. stolonifer (Ehrenb.: Fr.) Vuill. var . stolonifer не превышает 8,4 %. Встречаемость Rh. microsporus V. Tiegh. var. microsporus составляет всего 0,3–0,4 % [21].

Рисунок 1 – Частота встречаемости видов грибов рода Rhizopus Ehrenb. на посевах подсолнечника в Краснодарском крае за период 2006–2011 гг.

В связи со сложностью и длительностью установления групп видов рода Rhi-zopus Ehrenb. по системе Schipper (1984) возникла необходимость изучить подходы к определению видов, описанные Г.А. Кочкиной с соавторами (1989).

Материалы и методы. Для уточнения диагностических признаков видов грибов рода Rhizopus Ehrenb. на подсолнечнике исследовали 300 корзинок, пораженных сухой гнилью, в Краснодарском крае. Выделение возбудителя в чистую культуру, изучение его морфологических признаков осуществлялось по общепринятым методикам [22; 23; 24; 25]. Культивирование штаммов, выделенных из пораженных сухой гнилью корзинок, проводили на картофельно-глюкозном агаре (КГА) в чашках Петри в трехкратной повторности при различных температурных режимах (25, 35, 45, 50 ºС). Укол споровой суспензии (10⁷ спор/мл) делали в центр чашки. Диаметры выросших колоний измеряли утром и вечером после посева в течение 3 суток культивирования.

Вычисление радиальной скорости проводили по формуле:

Kr= (r – ro) / (t – to), где K – радиальная скорость роста;

r o – радиус колоний в начальный момент времени t o ;

r – радиус колоний в момент времени t [26].

Видовую принадлежность грибов рода Rhizopus Ehrenb. в крае устанавливали по классификации, разработанной Schipper M.M.A. (1984), и диагностическим признакам Кочкиной и Мирчинк [15; 16].

Результаты и обсуждение. По нашим многолетним наблюдениям (1999–2011), в Краснодарском крае отмечается ежегодное поражение растений подсолнечника грибами рода Rhizopus. В условиях сухого жаркого лета частота встречаемости составляет 16–35 %, а у некоторых сортов и гибридов количество больных растений достигает 60 %. В годы с достаточной влагообеспеченностью растений и умеренной температурой (2000, 2001, 2004) частота встречаемости находится в пределах 4–6 %.

Типичные симптомы проявления сухой гнили наблюдаются в начале созревания подсолнечника. Сначала на тыльной стороне корзинки появляется небольшое мокнущее пятно светло-коричневого цвета. Оно быстро увеличивается в размерах и захватывает всю поверхность корзинки. Пораженные возбудителем болезни размягченные ткани через некоторое время теряют влагу, становятся темно-коричневыми и мумифицируются. При сильном развитии мицелий гриба проникает внутрь корзинки, переплетает паренхиму и распространяется на лицевую сторону корзинки, заполняя грязно-белым войлочным мицелием пространство между семянками. Они слипаются, становятся щуплыми и горькими на вкус. Ячейки с семенами легко отделяются от основной ткани корзинки. Развитие болезни усиливается, если в фазе созревания подсолнечника наблюдается чередование сухой и дождливой погоды (рис. 2).

Рисунок 2 – Симптомы проявления сухой гнили на подсолнечнике

Видовую принадлежность грибов рода Rhizopus невозможно установить по внешним симптомам проявления болезни на корзинке. Затрудняет идентификацию по системе Schipper (1984) определение вида по признакам половой репродукции, так как довольно сложно у гетероталлич-ных представителей этого рода зафиксировать и описать зигоспоры, цвет и размеры которых являются дифференцирующим признаком разделения на виды. Интересна в практическом отношении работа Г.А. Кочкиной с соавторами, которые при идентификации используют не только морфологические, но и физиологические свойства видов грибов рода Rhi-zopus Ehrenb.

Проведенные нами исследования показали, что средняя радиальная скорость роста на агаровой среде при различных температурах специфична для видов и разновидностей грибов рода Rhizopus Eh-renb. У группы «microsporus» при 25 ^оС скорость роста мицелия в 2–2,8 раза ниже, чем у « stolonifer» и «oryzae» . При повышении температуры до 45 ^оС она увеличивается в 2 раза. При температуре 35 ^оС штаммы Rh. oryzae обладали максимальной скоростью роста . При 45 ^оС ни в одной из 253 чашек развития гриба зафиксировано не было. У видов группы « stolonifer» наиболее интенсивный рост мицелия отмечался при 25 ^оС, а при 36 ^оС наблюдалось отсутствие роста колоний на агаре (табл. 1).

Таблица 1

Средняя радиальная скорость роста видов рода Rhizopus Ehrenb.

Краснодар, ВНИИМК, 2009–2011 гг.

Вид	Число испытанных штаммов, шт.	Средняя радиальная скорость роста, см/ч, при разных температурах
		25	35	45	50
Rh. oryzae Went et Pringle	253	0,148 ± 0,030	0,230 ± 0,023	роста нет	роста нет
Rh.stolonifer (Ehrenb.: Fr.) Vuill. var . stolonifer	35	0,200 ± 0,013	роста нет	роста нет	роста нет
Rh. microsporus V. Tiegh. var. microsporus	12	0,070 ± 0,050	0,145 ± 0,030	0,155± 0,010	роста нет

Таким образом, проанализировав рост культуры на агаре при 25 оС можно сделать предположение относительно при- надлежности ее к той или иной группе. Использование показателя средней радиальной скорости роста мицелия на агаровой среде, в качестве дополнительного физиологического критерия, облегчает разделение грибов рода Rhizopus Ehrenb. на группы.

Микроскопические наблюдения при изучении морфологических признаков показали, что виды различаются по орнаментации поверхности спор, которая не меняется от температуры культивирования штаммов (рис. 3).

Рисунок 3 – Орнаментация поверхности спорангиоспор: а) Rh. oryzae Went et Pringle; б) Rh. stolonifer (Ehrenb.: Fr.) Vuill. var . stolonifer ; в) Rh. microsporus V. Tiegh. var. microsporus

У вида Rh. oryzae Went et Pringle споры 6–9 × 4–6 мкм в диаметре, эллиптически-шаровидные, продолговатые, исчерченные. Спорангиоспоры вида Rh. stolonifer (Ehrenb.: Fr.) Vuill. var . stolonifer эллиптические, округлые, угловатые, штриховато-полосатые (8–14 × 5–10) мкм. На поверхности спорангиоспор Rh. micro-sporus V. Tiegh. var. microsporus наблюдаются отчетливые борозды, параллельные длинной оси споры.

Изучение поверхности спор показало, что этот признак можно использовать в качестве диагностического признака при определении видов.

Одной из отличительных особенностей видов грибов рода Rhizopus Ehrenb. являются их ризоиды. Для вида Rh. oryzae Went et Pringle характерны слабо разветвленные, буровато-коричневые. У вида Rh. stolonifer (Ehrenb.: Fr.) Vuill. var . stolonifer ризоиды хорошо развиты, разветвленные, коричневые. Вид Rh. microsporus V. Tiegh. var. microsporus отличается своими меньшими размерами. Ризоиды короткие, слегка пигментированные (рис. 4).

Выводы. В Краснодарском крае симптомы сухой гнили на корзинках подсолнечника появляются в фазе созревания. Пораженные грибами рода Rhizopus Eh-renb. ткани корзинки сначала мягкие, светло-коричневые, затем становятся твердыми, темно-коричневыми. При сильном поражении, в отличие от склеро-тиниоза, дно корзинки не вываливается, склероции не образуются. Показатель радиальной скорости роста культуры на агаре при температуре 25 оС облегчает разделение рода Rhizopus Ehrenb. на группы: «oryzae», «stolonifer», «microspo-rus». Орнаментация поверхности спорангиоспор может служить вспомогательным признаком при идентификации грибов рода Rhizopus Ehrenb. Отличительным морфологическим признаком видов являются ризоиды. У вида Rh. oryzae Went et Pringle они слабо разветвленные, буровато-коричневые. Вид Rh. stolonifer (Eh-renb.: Fr.) Vuill. var. stolonifer имеет ризоиды хорошо развитые, разветвленные, коричневые. Для вида Rh. microspo-rus V.Tiegh. var. microsporus характерны короткие, слегка пигментированные ризоиды.

Рисунок 4 – Ризоиды: а) Rh. оryzae Went et Pringle; б) Rh. stolonifer (Ehrenb.: Fr.) Vuill. var . stolonifer; в) Rh. microsporus V.

Tiegh. var. microsporus .