Существующие проблемы и пути их решения при анализе аминокислотного состава

Аминокислоты играю огромную роль в процессах жизнедеятельности живых организмов, являясь структурной единицей белков. Они отвечают за транспорт и хранение питательных веществ, функционирование и восстановление различных тканей, в том числе мышц, костей, волос. В природе обнаружено уже более 700 аминокислот, 21 из них протеиногенная, то есть кодируется генетическим кодом.

Анализ аминокислот важен для различных областей: пищевой промышленности, производства лекарств, клинических анализов и т. д. Среди большого числа разработанных подходов (тонкослойная, ионообменная, газовая хроматография) наиболее чувствительными являются методики, основанные на хроматографическом разделении целевых аналитов с использованием различных видов дериватизации: пред- и постколоночной. Использование дериватизирующих агентов позволяет решить проблемы, возникающие при их хроматографическом разделении:

─ высокая полярность молекул аминокислот за счет наличия карбоксильной и аминогрупп не позволяет разделить их хроматографически без использования ионообменных неподвижных фаз;

─ низкие коэффициенты поглощения аминокислот в ультрафиолетовой области [1]

затрудняют их детектирование и не позволяют достичь низких пределов обнаружения.

При предколоночной дериватизации используют ортофталевый ангидрид (рисунок 1), а дериватизаты после ВЭЖХ-разделения детектируют с использованием УФ-детектора. Недостатком этого метода является наблюдае- мое в ряде случаев разложение дериватизатов до завершения анализа.

CHO

+ HS-CH3-CH2-OH * H2N-R —•

"CHO 2-меркаптоэтанол амино-группа фталевый ангидрид zCH2-CH2-OH

Рисунок 1. Реакция фталевого ангидрида с аминогруппой аминокислот

Figure 1. The reaction of the phthalic anhydride with amino acid group

При постколоночной дериватизации в качестве реагента используют нингидрин (рисунок 2), позвляющий получить стабильные дериватизаты после разделения аминокислот на ионообменной колонке. Дериватизаты при этом детектируются спектрофотометрически.

Flow Diagram S 433

Рисунок 2. Постколоночная дериватизация аминокислот нингидрином

Figure 2. Post-column ninhydrin derivatization of aminoacids

Для анализа на аминокислотный состав белковых и пептидных препаратов важным является выбор пробоподготовки, необходимо сначала провести исчерпывающий гидролиз этих полимеров до отдельных аминокислот и учесть при этом все возможные потери.

Стандартная процедура разложения белка до аминокислот – кислотный гидролиз (6М раствор соляной кислоты при температуре 110 °С [1–6]) – позволяет в дальнейшем определить все аминокислоты, кроме серосодержащих (цистеин и метионин).

Серосодержащие аминокислоты при кислотном гидролизе частично разлагаются, поэтому для точного определения их количества в пробе необходимо предварительно перевести их в стабильные соединения (рисунок 3) – цистеиновую кислоту и метионинсульфон соответственно. Для этого проводят окисление указанных аминокислот путем охлаждения (0 – 5 ºС) с надмуравьиной кислотой в течение 18 ч. Далее уже можно проводить кислотный гидролиз и количественное определение цистеиновой кислоты и метионинсульфона с последующим пересчетом на исходные аминокислоты [1, 2, 5, 6].

Рисунок 3. Реакция окисления метионина

Figure 3. Reaction of methionine oxidation

Отдельно отметим, что при кислотном гидролизе триптофан полностью разлагается, поэтому для его определения используют щелочной гидролиз (гидроксид бария, 110 ºС, 20 ч [7]).

Цель работы – сравнение методов с пред-и постколоночной дериватизацией на примере анализа образца сульфата лизина. Метод, который покажет наилучшую точность, будет в дальнейшем использован для отработки методов пробоподго-товки образцов белков и пептидов на содержание валина и треонина.

Материалы и методы

Реактивы и материалы

Оборудование

Анализатор аминокислотный HITACHI L-8900 (Япония); анализатор аминокислотный Sykam S 433 (Германия); хроматограф жидкостной 1290 Infinity II LC (Agilent Technologies, Германия); весы неавтоматического действия Mettler Toledo XPE 204 (Швейцария); электропечь сопротивления низкотемпературная лабораторная SNOL 67/350 (Литва)

Результаты и обсуждение

В образцах сульфата лизина было проведено определение содержания указанной аминокислоты в свободной форме. Как заявляет производитель, содержание лизина в продукте должно быть не меньше 55%. Испытания проводились двумя методами анализа: с пред-и постколоночной дериватизацией (таблица 1).

Таблица 1.

Результаты анализа сульфата лизина

Table 1.

Results of analysis of lysine sulfate

Название, номер пробы Sample name, sample number	Содержание лизина, % Lysine content, %
	Дериватизация Derivatization				Европейская аккредитованная лаборатория [9] European Accredited Laboratory	Заявлено Control
	Пред-колоночная Pre-column	∆ от независимого определения ∆ to control	Постколоночная [8] Post-column	∆ от независимого определения ∆ to control
Сульфат лизина № 1 Lysine sulphate № 1	42,5	16,3	56,1	2,8	58,8	≥55
Сульфат лизина № 2 Lysine sulphate № 2	49,8	6,4	54,9	1,3	56,2	≥55
Сульфат лизина № 3 Lysine sulphate № 3	50,9	7,0	58,3	0,4	57,9	≥55

Экспериментально показано, что при постколоночной дериватизации результаты согласуются с теми, что измерены в независимой Европейской аккредитованной лаборатории. Таким образом, этот метод был выбран для дальнейшей работы.

Для определения оптимальной пробопод-готовки образцов белков и пептидов на валин и треонин в качестве первой стадии был выбран кислотный гидролиз, т. к. целевые аналиты не являются серосодержащими и не требуется определения триптофана.

После процесса кислотного гидролиза перед анализом рН в образце необходимо довести до 2,2. Для этого возможно использование двух подходов:

─ полностью выпарить соляную кислоту и перерастворить образец в буфере с соответствующим рН;

─ довести рН в образце после гидролиза до нужного значения путем добавления щелочи.

Экспериментально было установлено, что при использовании первого подхода гидрофобные аминокислоты (например, валин) не полностью перерастворяются после упаривания, и итоговые результаты анализа получаются заниженными (таблица 2). Предположительно, это связано с частичным «запеканием» целевых аналитов с углеводами.

Второй же подход, несмотря на большой расход дополнительного реактива (0,3 г щелочи на 1 пробу), дает более точные результаты.

Таблица 2.

Сравнение результатов разных способов пробоподготовки

Table 2.

Comparison of results of different methods of sample preparation

Аминокислота в пробе Aminoacid in sample	Содержание аминокислот, % Aminoacids content, %				Европейская аккредитованная лаборатория [9] European Accredited Laboratory
	Метод перерастворения Reconstitution method	∆ от независимого определения ∆ to control	Метод добавки щелочи Basic addition method	∆ от независимого определения ∆ to control
Валин Valine	0,64	0,33	0,96	0,01	0,97
Треонин Threonine	0,79	0,05	0,84	0	0,84

Заключение

Проведено сравнение методов анализа аминокислот с пред- и постколоночной дерива-тизацией на примере определения содержания сульфата лизина. Экспериментально доказано преимущество использования постколоночной дериватизации с нингидрином.