Связь особенностей экспрессии интегринов 1 и 3 с лимфогенным метастазированием при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы с учетом морфологической гетерогенности опухоли

Крахмаль Н.В., Телегина Н.С., Завьялова М.В., Вторушин С.В., Крохмаль В.А., Перель-мутер В.М. Связь особенностей экспрессии интегринов β1 и β3 с лимфогенным метастазированием при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы с учетом морфологической гетерогенности опухоли. Сибирский журнал клинической и экспериментальной медицины. 2021;36(4):78–85.

Financial disclosure:

no author has a financial or property interest in any material or method mentioned. The study was supported by Grant of the President of the Russian Federation No. НШ-2701.2020.7 “Development of new approaches to predicting the course of breast carcinomas based on morphological and molecular-genetic tumor heterogeneity”.

Актуальность

Интегрины представляют собой одно из наиболее изученных семейств поверхностных рецепторов, способных формировать связи с молекулами внеклеточного матрикса и обладающих свойством трансформировать сигналы микроокружения во внутриклеточные сигналы, запуская тем самым множество каскадных механизмов клеточного ответа. По природе интегрины являются нековалентно связанными гетеродимерными трансмембранными молекулами (гликопротеины), в состав которых входят α- и β-субъединицы, выполняющие роль клеточного рецептора и не обладающие собственной ферментативной активностью. Интегрины осуществляют запуск биохимических и механических сигналов, контролирующих клеточный фенотип, что, в свою очередь, может определять дальнейшую судьбу клетки. На данный момент у человека было охарактеризовано 18 α- и 8 β-субъединиц, образующих около 24 комбинаций αβ-рецепторов с различной субстратной специфичностью [1, 2].

Интегрины, связывающие Arg-Gly-Asp последовательность (RGD-пептид), принадлежат к наиболее изученному подсемейству, которое включает αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8, α5β1 и αIIbβ3 интегрины. Представители данного подсемейства распознают RGD-последовательность в некоторых компонентах внеклеточного матрикса, среди них фибронектин, витронектин, остеопонтин и фибриноген. Интегрины, участвующие в связывании клеток с коллагеном или ламинином, объединяют в другое подсемейство, которое включает β1 (α1β1, α2β1, α10β1, α11β1, α6β1) или β4 (α6β4) [1]. В этих взаимосвязях интегрины осуществляют двунаправленную коммуникацию между клетками и структурами внеклеточного матрикса [3].

Особое значение для данного исследования представляют интегрины семейства β1 и β3, поскольку именно этим молекулам отведена значимая роль в онкогенезе рака молочной железы (РМЖ). Функции интегринов β1 широко связаны с регуляцией многих клеточных процессов, таких как пролиферация, клеточная адгезия, дифференцировка, миграция и онкогенная трансформация клеток молочной железы. Так, к примеру, делеция гена субъединицы интегрина β1 в базальных или люминальных клетках ставит под угрозу регенераторный потенциал эпителия железы, что обусловливает роль интегринов β1 в поддержании пула стволовых клеток [2].

Цепь интегрина β1 может связывать различные α-субъединицы, которые определяют специфичность лиганда внеклеточного матрикса к гетеродимеру инте-грина. Мало что известно о вкладе отдельных димеров интегрина в развитие тканевых и клеточных структур молочной железы, при этом отмечен тесный синергизм сигнальных путей интегринов и EGFR (Epidermal growth factor receptor) [1, 2, 4]. При инвазивной карциноме молочной железы повышенная экспрессия интегрина β1 в опухоли коррелирует с плохой выживаемостью, что де- монстрирует его вклад в формирование более злокачественного потенциала в клетках новообразования [3]. Показано, что ремоделирование микроокружения с повышением жесткости фибриллярных коллагенов под действием лизилоксидазы, а также повышение содержания β1 интегрина при РМЖ коррелируют с возникновением процессов злокачественной трансформации нормальной ткани в инвазивную карциному, определяя худший общий прогноз [5].

Интегрин β3 в составе αvβ3-гетеродимера также связывается со многими белками внеклеточного матрикса, усиливает пролиферацию и миграцию за счет фосфорилирования нижестоящих сигналов киназного пути фокальной адгезии (FAK). Экспериментальные исследования демонстрируют способность интегринов осуществлять контроль над метастатической способностью клеток РМЖ в ткань головного мозга [6]. T. Bui и соавт. провели исследование, в котором изучение влияния комбинированной делеции β1-/β3-интегринов на прогрессирование, пролиферативный и апоптотический статус опухолей молочной железы, управляемых и регулируемых ErbB2 рецептором тирозинкиназы, показало уменьшение количества пролиферирующих клеток с возникновением нарушений в прогрессии заболевания и маргинальное увеличение количества апоптотических клеток. Кроме того, в работе было подтверждено снижение клеточной адгезии к фибронектину и распространения клеток опухоли за счет уменьшения образования устойчивых фокальных адгезионных комплексов. Исследование демонстрирует потребность в интегрине β1 в процессах метастазирования. Оценка метастатической пенетрантности и количества метастазов в легких в условиях комбинированной делеции β1-/β3-интегринов показала как уменьшение количества метастазов в легочной ткани, так и снижение пенетрантности. При этом селективная делеция интегринов β1 оказывает большее влияние на процессы опухолевой диссеминации, чем селективная делеция интегринов β3 [7].

Известно, что для РМЖ характерным является наличие выраженной внутриопухолевой гетерогенности, при этом между опухолевыми клетками и компонентами микроокружения карциномы существуют сложные взаимодействия. Стромальные клетки, внеклеточный матрикс и межклеточная жидкость в значительной мере определяют процессы опухолевой прогрессии и метастазирования [3, 8]. В свою очередь, особенности микроокружения опухоли могут влиять на формирование клинически значимых вариаций фенотипов РМЖ и, возможно, способны предсказать исход [9]. Экспрессия и активность интегринов, их адгезионные свойства являются важными в процессах онкогенеза, определяя вероятность метастазирования, а также формирования лекарственной устойчивости опухоли [10]. В связи с этим определенный интерес представляло исследование и оценка экспрес-сионных характеристик описанных маркеров в опухоли при РМЖ, сопоставление полученных результатов с особенностями гетерогенности строения карцином данной локализации и показателями лимфогенной опухолевой диссеминации.

Материал и методы

Группу исследования составили 107 пациенток, которые проходили лечение в отделении общей онкологии НИИ онкологии Томского НИМЦ. У всех пациенток был диагностирован РМЖ, гистотип опухоли в 100% случаев соответствовал по морфологии инвазивной карциноме неспецифического типа (инвазивная протоковая карцинома) молочной железы. Возраст пациенток варьировал от 29 до 85 лет (средний возраст – 57,2 ± 11,2 года), 74,8% ( n = 80) составили женщины старше 50 лет, меньшими по количеству оказались группы в возрасте от 35 до 50 лет – 23,4% ( n = 25) и до 35 лет – 1,8% ( n = 2). У 31 пациентки (29%) менструальная функция была сохранена (возраст 45,7 ± 8,1 года), у 76 (71%) определялось состояние менопаузы (возраст 61,9 ± 8,6 года). Предоперационное лечение больные не получали. В 49% случаев ( n = 52) объем оперативного пособия соответствовал радикальной мастэктомии, в 51% ( n = 55) – секторальной резекции молочной железы с аксиллярной лимфаденэктомией. Стадию заболевания оценивали в соответствии с международной классификацией опухолей молочной железы по системе TNM (WHO Classification of Tumors Editorial Board. Breast Tumours; Lyon, 2019).

Чаще выявлялись I и IIA стадии ( n = 49 и n = 33 соответственно), реже диагностировали IIB ( n = 14), IIIA ( n = 9), IIIB ( n = 1) и IIIC ( n = 1) стадии процесса. Новообразования наиболее часто располагались в наружных квадрантах молочных желез (48,6%; n = 52), реже – во внутренних квадрантах (25,23%; n = 27) и на границе наружных и внутренних квадрантов (24,3%; n = 26). Центральная локализация процесса наблюдалась лишь в 1,87% случаев

( n = 2). В исследуемой группе преобладали опухоли, размер которых соответствовал 2–5 см и менее 2 см (52,34%; n = 56 и 46,73%; n = 50 соответственно), в 0,93% случаев ( n = 1) размер первичного новообразования составил более 5 см.

Выполняли морфологическое исследование операционного материала. Макроскопически оценивали ткань первичной опухоли молочной железы и ткань органа вне новообразования с целью исключить случаи с мульти-центрическим ростом. Аксиллярную клетчатку детально исследовали на предмет выявления всех имеющихся в пределах операционного материала лимфатических узлов. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч с последующей вырезкой образцов. Проводку, заливку материала в парафин и изготовление гистологических срезов осуществляли по стандартной методике с окраской препаратов гематоксилином и эозином. В полученных срезах морфологическое исследование ткани первичной опухоли проводили согласно следующему алгоритму: определяли гистологический тип РМЖ и оценивали степень злокачественности новообразования.

Гистотип устанавливали в соответствии с классификацией опухолей молочной железы (WHO Classification of Tumors Editorial Board. Breast Tumours; Lyon, 2019). В исследование включали только случаи с классической морфологией инвазивной карциномы неспецифического типа. Степень злокачественности определяли по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. В паренхиматозном компоненте опухоли оценивали наличие различных типов структур: альвеолярных, трабекулярных, тубулярных и солидных, а также дискретные группы опухолевых клеток (рис. 1). К альвеолярным структурам относили комплексы опухолевых клеток (15– 20 клеток) округлой или слегка неправильной округлой формы.

Рис. 1. Опухолевые структуры паренхиматозного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение × 400. Стрелками указаны: A – альвеолярные структуры, B – тубулярные структуры, C – паренхиматозный компонент опухоли с разными структурами, D – трабекулярные структуры, E – солидные структуры, F – группы опухолевых клеток в строме опухоли

Fig. 1. Tumor structures in parenchymal component of nonspecific invasive breast carcinoma. Hematoxylin and eosin stain, × 400. Arrows indicate:

A – alveolar structures, B – tubular structures, C – parenchymal component of tumor with different structures, D – trabecular structures, E – solid structures, F – groups of tumor cells in the tumor stroma

Трабекулярные структуры представляли собой один ряд мелких относительно мономорфных клеток либо 2– 3 практически параллельно расположенных ряда клеток средних размеров с умеренно выраженной цитоплазмой, с округлыми нормохромными или гиперхромными ядрами.

Тубулярными считали однорядные по типу «замыкающих» опухолевые структуры с наличием просвета в центре, образованные достаточно мономорфными клетками с нормохромными округлыми ядрами. К солидным относили структуры, представляющие собой различные по размеру и форме поля, состоящие из мелких клеток с умеренно выраженной цитоплазмой и мономорфными ядрами или из крупных клеток с обильной цитоплазмой и полиморфными ядрами, плотно прилежащих друг к другу. Дискретно располагающиеся в строме новообразования скопления от 1 до 4 клеток, различные по своему строению, считали группами клеток.

В большинстве случаев паренхиматозный компонент первичной опухоли молочной железы имел смешанное строение, в котором отмечалось наличие вариаций в сочетании разных типов перечисленных выше структур (см. рис. 1). Кроме того, в каждом случае при оценке паренхиматозного компонента подсчитывали количество разных типов структур (от 1 до 5). При исследовании лимфатических узлов подсчитывали общее количество лимфоузлов, оценивали наличие в них метастатического поражения и количество лимфоузлов с метастазами.

Иммуногистохимическое исследование проводили с применением антител фирмы Abcam к интегрину β3 ab75872 (Сlone EPR2417Y; кроличьи моноклональные; 1 : 250) и к интегрину β1 ab3167 (Сlone 4B7R; мышиные моноклональные; 1 : 20) (рис. 2). Экспрессию исследуемых маркеров в структурах паренхиматозного компонента первичной опухоли инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы оценивали по следующим параметрам: наличие (позитивная экспрессия) или отсутствие (негативная экспрессия) экспрессии; процент опухолевых клеток с позитивной экспрессией маркера (в 10 полях зрения на 1000 клеток при увеличении × 400).

Исследование выполнялось с применением светового микроскопа Carl Zeiss Axio Lab.A1 (Германия). Статистическая обработка полученных данных выполнялась с использованием пакета программ STATISTICA 10.0. Применялись дисперсионный анализ и критерий χ². Обсуждались результаты со статистической значимостью различий при р < 0,05 и с тенденцией к различиям при р < 0,1.

Рис. 2. Наличие позитивной экспрессии интегрина β1 и интегрина β3 в структурах паренхиматозного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы. Увеличение × 400

Fig. 2. Presence of positive β1 and β3 integrin expression in the structures of parenchymal component of nonspecific invasive breast carcinoma, × 400

Результаты и обсуждение

Морфологическое исследование образцов опухолевой ткани молочной железы показало следующие результаты. Оценка паренхиматозного компонента новообразования молочной железы выявила, что наименьшими по частоте встречаемости в опухоли являлись тубулярные структуры (49%), при этом альвеолярные (73%; р = 0,0002), трабекулярные (85%; р = 0,0000), солидные (65%; р = 0,009) структуры, в том числе группы клеток (75%; р = 0,0001), определялись значимо чаще и приблизительно с одинаковой частотой. Подсчет количества разных типов структур в паренхиматозном компоненте показал, что почти каждый образец характеризовался различным сочетанием опухолевых структур.

Наиболее часто выявлялись разнообразные по строению опухоли, паренхиматозный компонент которых включал до 4 типов структур. Представленные исключительно одним типом опухолевых структур мономорфные новообразования молочной железы диагностировали статистически значимо реже (1,87%; n = 2) по сравнению с карциномами, в которых присутствовали 2 (18,69%; n = 20; p = 0,0000), 3 (26,17%; n = 28; p = 0,0000), 4 (37,38%; n = 40; p = 0,0000) или 5 типов структур (15,89%; n = 17; p = 0,0002).

Следующим этапом с применением метода иммуногистохимии в опухолевой ткани проводили оценку экспрессии изучаемых маркеров с учетом морфологического строения карциномы молочной железы. Изучение особенностей экспрессии показало, что наличие пози- тивной экспрессии интегрина β1 чаще наблюдалось в солидных структурах (35%; n = 27) по сравнению с тубулярными (15%; n = 6; p = 0,01), трабекулярными (16%; n = 9; p = 0,008) структурами и группами опухолевых клеток (14%; n = 4; p = 0,01). При этом наиболее высокий процент позитивной экспрессии интегрина β1 отмечался в тубулярных структурах и в группах опухолевых клеток (таблица). Позитивная экспрессия маркера интегрина β3 статистически значимо чаще определялась в солидных структурах (72%; n = 68), а также в дискретных группах опухолевых клеток (65%; n = 64). При сопоставлении показателей частоты позитивной экспрессии маркера между структурами было отмечено наличие статистически значимых различий между солидными структурами и альвеолярными (19%; n = 11; p = 0,0000), тубулярными (25%; n = 9; p = 0,0000) и трабекулярными структурами (22%; n = 12; p = 0,0000). Аналогичного рода закономерность прослеживалась и в отношении групп опухолевых клеток, в которых значимо чаще регистрировалась позитивная экспрессия интегрина β3 нежели в альвеолярных, тубулярных и трабекулярных структурах (p = 0,0000). Наиболее высокий процент позитивной экспрессии интегрина β3 отмечался в трабекулярных и солидных структурах, при этом тубулярные структуры и группы опухолевых клеток характеризовались наименьшим процентом экспрессии маркера (см. табл.).

Таблица. Позитивная экспрессия интегрина β1 и β3 в разных структурах паренхиматозного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы, %

Table. Positive β1 and β3 integrin expression in different structures of parenchymal component of nonspecific invasive breast carcinoma, %

Локализация экспрессии Expression localization		Экспрессия интегрина β1, М ± SD Percentage of β1 integrin expression, М ± SD	Экспрессия интегрина β3, М ± SD Percentage of β3 integrin expression, М ± SD
Альвеолярные структуры Alveolar structures	1	38,8 ± 13,9 ( n = 15)	13,6 ± 6,2 ( n = 11)
Тубулярные структуры Tubular structures	2	61,2 ± 10,1 ( n = 6) p 1 = 0,0010 p 3 = 0,0001 p 4 = 0,0300	7,5 ± 0,3 ( n = 9) p 1 = 0,0040 p 3 = 0,0020 p 4= 0,0000
Трабекулярные структуры Trabecular structures	3	33,3 ± 10,7 ( n = 9)	25,9 ± 16,3 ( n = 12)
Солидные структуры Solid structures	4	44,2 ± 19,9 ( n = 27)	21,1 ± 7,0 ( n = 68)
Группы клеток Groups of tumor cells	5	70,5 ± 13,8 ( n = 4) p 1 = 0,0004 p 3 = 0,0001 p 4 = 0,0080	8,4 ± 1,9 ( n = 64) p 1 = 0,0000 p 3 = 0,0000 p 4= 0,0000

Сопоставление особенностей экспрессии маркеров интегрина β1 и интегрина β3 в структурах паренхиматозного компонента со степенью злокачественности опухоли позволило выявить следующую зависимость. Позитивная экспрессия интегрина β1 статистически значимо реже обнаруживалась при второй степени злокачественности, чем при первой (19%; n = 15 и 45,5%; n = 5; p = 0,03 соответственно). В отношении экспрессии интегрина β3 исследование показало диаметрально противоположные результаты. Позитивная экспрессия интегрина β3 значимо чаще определялась в опухолях, по морфологии соответствующих второй степени злокачественности, и значимо реже – при первой (77%; n = 61 и 45,5%; n = 5; p = 0,01 соответственно). В случаях опухолей с третьей степенью злокачественности отчетливых закономерностей обнаружено не было.

Морфологическое исследование и оценка паренхиматозного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы и последующее сопоставление полученных результатов с показателями лимфогенного метастазирования позволило выявить ряд взаимосвязей. Количество лимфатических узлов с наличием метастатического поражения не было ассоциировано с обнаружением в паренхиме конкретных опухолевых структур. Кроме того, количество разных типов структур в паренхиматозном компоненте новообразования не было связано ни с частотой, ни с выраженностью лимфогенного метастазирования.

Представляющие определенный интерес результаты были получены при сопоставлении особенностей экспрессии интегринов семейств β1 и β3 в структурах опухоли с показателями лимфогенной диссеминации. Очаги метастатического поражения в лимфатических узлах значимо реже определялись при наличии позитивной экспрессии интегрина β1 в альвеолярных (20%) и солидных (22%) структурах по сравнению со случаями с негативной экспрессией маркера в аналогичных структурах (48%; χ² = 3,5; р = 0,05 и 48%; χ²= 4,8; р = 0,02 соответственно). Лимфогенные метастазы наблюдались статистически значимо чаще при наличии позитивной экспрессии инте-грина β3 в дискретных группах клеток по сравнению со случаями, в которых экспрессия изучаемого маркера в описанных структурах была негативной (47 и 23% соответственно; χ² = 5,1; р = 0,02). Исследование продемонстрировало, что при наличии лимфогенных метастазов значимо чаще нежели при их отсутствии определялся более высокий процент экспрессии интегрина β3 в альвеолярных (22,5 ± 4,1; n = 6 и 3,0 ± 0,3; n = 5; р = 0,0000 соответственно), трабекулярных (43,8 ± 15,4; n = 6 и 8,0 ± 4,0; n = 6; р = 0,0000 соответственно), солидных структурах (31,4 ± 4,0; n = 27 и 14,2 ± 8,6; n = 41; р = 0,0000 соответственно) и дискретных группах опухолевых клеток

(12,6 ± 6,6; n = 30 и 4,8 ± 2,1; n = 34; р = 0,0000 соответственно). В тубулярных структурах процент экспрессии интегрина β3 при наличии в лимфатических узлах метастазов был минимальным (3,2 ± 0,8; n = 4).

Исследование зависимости экспрессионных характеристик ткани опухолей и клинико-морфологических параметров позволило определить ряд особенностей. Было установлено, что увеличение степени злокачественности карциномы молочной железы ассоциировано с уменьшением частоты случаев с наличием позитивной экспрессии интегрина β1 и с увеличением частоты случаев с позитивной экспрессией интегрина β3. Описанный вектор изменения экспрессионного профиля исследуемых маркеров сопряжен с увеличением частоты случаев метастатического поражения лимфоузлов. На основании полученных данных можно сделать предположение о том, что степень злокачественности выше при наличии в клетках опухоли инвазивных признаков, определяющих процессы лимфогенной диссеминации. При уточнении характера изменения экспрессии изучаемых параметров в различных структурах паренхиматозного компонента опухоли обнаружено, что экспрессия маркеров в дискретных опухолевых клетках также сопряжена со степенью злокачественности. Наибольший интерес в этом плане представляет усиление экспрессии интегринов β1 и β3. В литературе имеются сведения о том, что повышенная экспрессия в ткани опухоли интегрина β3 в случаях РМЖ, ассоциированная с высокой миграционной способностью злокачественно трансформированных клеток, определяет высокий злокачественный потенциал карциномы [11].

Данные, полученные в результате нашего исследования, также указывают на такую взаимосвязь. Наряду с этим, представленная в литературных источниках информация относительно экспрессии интегрина β1 подтверждает его значение и участие в процессах пролиферации клеток, миграции и инвазии, что, в свою очередь, определяет прогрессирование болезни. Авторы отмечают, что высокая экспрессия маркера интегрина β1 при протоковой карциноме in situ молочной железы может быть ассоциирована с агрессивным течением, а повышенный уровень данного показателя при инвазивных формах сочетается с низкой выживаемостью пациентов, короткими безрецидивным и безметастатическим периодами [1, 12, 13].

Заключение

Таким образом, полученные в результате нашего исследования данные относительно существования взаимосвязи между экспрессией интегринов семейства β1 и β3 при инвазивной карциноме молочной железы неспецифического типа в разных структурах опухоли с показателями лимфогенной диссеминации расширяют и дополняют известные ранее сведения. Так, N.E. Ramirez и соавт. в эксперименте на моделях РМЖ у мышей продемонстрировали, что интегрины семейства β1 скорее подавляют образование метастазов, подтверждая этот факт регистрацией высокой экспрессии маркера в клетках нормального эпителия молочной железы и его утратой при развитии карциномы. Эта закономерность позволила предположить, что интегрины семейства β1 могут являться функциональными ингибиторами возникновения метастатических очагов [14]. S. Havaki в своем исследовании связывает повышение миграционной способности клеток опухоли и усиление их инвазивных свойств с повышенной экспрессией интегрина β3 в опухолевых клетках при РМЖ, что впоследствии также может определять развитие метастазов [11]. Результаты работы демонстрируют потенциальную возможность получения дополнительных новых факторов прогностического значения в случаях инвазивной карциномы молочной железы, основанную на изучении молекулярно-биологического профиля опухоли с оценкой экспрессии интегриновых рецепторов семейства β1 и β3.